【摘要】 本发明公开了一种基于trans-actingsmallRNA即TAS途径增强病毒诱导基因沉默效率的方法及应用。本发明通过对沉默载体中靶基因片段进行修饰，从而达到增强基因沉默效率的效果。该方法一方面提高了单位长度基因沉默效率，另一方面也提供了一种特异沉默植物同一家族中单个成员的新方法，从而为植物基因组功能的分析和研究服务。本发明构建棉花皱叶病毒基因沉默载体，并对该载体中插入沉默靶基因序列进行修饰，从而使该沉默载体通过TAS途径对宿主进行高效基因沉默。 【专利类型】发明授权 【申请人】浙江大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号 【申请人地区】中国 【申请人城市】杭州市 【申请人区县】西湖区 【申请号】CN201210250444.1 【申请日】2012-07-19 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102851310B 【公开公告日】2014-06-04 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102851310B 【授权公告日】2014-06-04 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N15/84; C12Q1/68 【发明人】周雪平; 顾周杭; 吴建祥 【主权项内容】1.一种基于trans-acting smallRNA即TAS途径以增强病毒诱导基因沉默效率的方法，其特征在于通过分子生物学方法对植物病毒沉默载体中沉默靶基因片段进行修饰，使其同时含有如下序列：5’TS(5’-GTGATTTTTCTCTACAAGCGAA-3’)的5’TS结构和3’MIR(5’-ATATTTGGAGACCGTCAGATTCGAATCTGAACAAAGCATAAAAAAGTCAACAAAACTTAAAGCGGCGGTCTCATCGTAATCTCAGCCCAATACCCTATTTTCCTCTCCCCTATATAAATACTTTCTTCTTCTACTGATCTTCTTCTCACAAATAAACCCAAATATATCAATCTACTGTGTTGGTGATTAAGTACTTTCGCTTGCAGAGAGAAATCACAGTGGTCAAAAAAGTTGTAGTTTTCTTAAAGTCTCTTTCCTCTGTGATTCTCTGTGTAAGCGAAAGAGCTTGCTCCCTAAACTTATCTCTCTGATGATTTAATGTTAGAGATCTTCGTAAATCTATGTGTTTGATAGATCTGATGCGTTTTTTGAGTTGATGATTTGATTATTTTTCACTGGAAAGTATCTCATTAGGGTAACGATAATGTTTTATGGATTTGGTTGTATAACAGATCCATGAAATCTTGACTGGTTATAAAATCTGAATAATGTATTTCAAT-3’)的miR73前体片段两部分序列，以达到增强基因沉默效率；对植物病毒沉默载体中沉默靶基因片段进行修饰的方法的步骤如下：首先将质粒pJRTCLCrVA.008和双元表达载体pCambia2300同时进行KpnⅠ+SacⅠ双酶切，具体反应条件为37℃30分钟 65℃20分钟；将经过双酶切反应后的pJRTCLCrVA.008 经过1%琼脂糖胶分离后，割胶回收大约2500bp片段，命名为CLCrVA.1；同时将经过KpnⅠ+SacⅠ双酶切的目的载体pCambia2300命名为2300.1；将CLCrVA.1利用KpnⅠ和SacⅠ酶切位点连接到2300.1上，得到pCLCrVA；1)在NCBI网站的GenBank中通过序列比对，需要沉默的靶基因CHLI序列，设计PCR克隆靶基因序列的特异引物Mir173_TS F：5’-gactagtcGTGATTTTTCTCTACAAGCGAAAGAAGTCCAGGCTCAAAT-3’和Mir173 su86bp R : 5’-ccttaattaaggTAGGTGCTACTGAAGATAGG-3’，其中F中的下划线为5’TS结构; 2)以植物棉花基因组DNA为模板，用步骤1设计的特异引物Mir173_TS F和Mir173 su86bp R通过PCR方法，使克隆的靶基因5’端含有5’TS结构，命名为tsSU，然后将tsSU通过SpeI和PacI酶切位点，构建到病毒沉默载体pCLCrVA中，得到pCLCrVtsSU；3)以拟南芥基因组为模板，通过miR173F：ccttaattaaggATATTTGGAGACCGTCAGATTCGA和miR73R：aggcgcgcctATTGAAATACATTATTCAGATTTTATAACC这对引物扩增得到500bp左右miR73前体片段，命名为3’MIR，然后将3’MIR通过AscI和PacI酶切位点，连入步骤2)的pCLCrVtsSU中，得到pCLCrVtsmiR173；4)将pCLCrVtsmiR173和pCLCrVB分别电击转化到农杆菌EHA105中，得到含pCLCrVtsmiR173的EHA105和含pCLCrVB的EHA105两个菌株；5)将含pCLCrVtsmiR173的EHA105和含pCLCrVB的EHA105菌液以1 : 1的比例混合后，一次性1ml注射器吸取上述混合液，在2-3周棉花幼苗子叶背面进行浸润，用针头在子叶背面刺小洞以便于浸润；6)浸润后的棉花幼苗，放于温室培养，培养条件为：温度为23～27℃，相对湿度为65 %～75 %，光周期为16L：8D；10-20天后观察CHLI基因沉默表型变化；7)经过实时定量PCR检测，相比于对照组CLCrVtsSu接种植株，接种pCLCrVtsmiR173的植株体内CHLI表达量下降情况。 【当前权利人】浙江大学 【当前专利权人地址】浙江省杭州市西湖区浙大路38号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12100000470095016Q 【引证次数】1.0 【自引次数】1.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】3

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