【摘要】 本发明公开了一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法。传统方法生产的5-氨基乙酰丙酸的产量不高。本发明在重组大肠杆菌培养的一定阶段进行短暂的厌氧发酵，从而改变重组大肠杆菌的代谢行为，具体的改进措施包括：在保藏编号为CGMCCNo.1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的培养过程的一定阶段，进行3075分钟的厌氧发酵，从而改变细胞的生理状态，适当降低细胞的生长速率，促进产物5-氨基乙酰丙酸的积累。本发明在专利200710068169.0的基础上，进一步改进5-氨基乙酰丙酸的发酵生产技术，所得的胞外5-氨基乙酰丙酸产量高，适合于工业化应用，前景广阔。 【专利类型】发明授权 【申请人】浙江大学; 苏州益安生物科技有限公司 【申请人类型】企业,学校 【申请人地址】310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号 【申请人地区】中国 【申请人城市】杭州市 【申请人区县】西湖区 【申请号】CN201210013562.0 【申请日】2012-01-17 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102747114B 【公开公告日】2014-09-03 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102747114B 【授权公告日】2014-09-03 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12P13/00; C12R1/19 【发明人】林建平; 朱力; 杨俊; 傅维琦; 岑沛霖 【主权项内容】1.一种用短暂厌氧发酵调节重组大肠杆菌代谢的方法，其特征在于如下步骤： 步骤(1).用接种针从保藏编号为CGMCC No.1939的工程菌Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA的甘油管中蘸取菌液后，在含有30～50μg/ml卡那霉素和30～50μg/ml氯霉素的LB培养基平板上划线，并将划线后的LB培养基平板放置于37℃下过夜培养； 步骤(2).将LB培养基平板上的单克隆接种于含30～50ml LB培养基的250ml摇瓶中，并放置在转速为200～220rpm，温度为37℃的摇床中过夜培养，得到一级种子； 步骤(3).取1～5ml一级种子接种于含50～100ml LB培养基的500ml的摇瓶中，并放置在转速为200～220rpm，温度为37℃的摇床中培养3～4h，得到二级种子； 步骤(4).将100～300ml二级种子接种于含7～9L发酵培养基的15L发酵罐中进行发酵培养，发酵罐的搅拌转速为300～500rpm, 空气流量为5～10L/min，起始培养温度为37℃；2～3h后培养温度降至26～30℃，并用0.02～0.2mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导； 所述的步骤(4)中的发酵培养基是由质量体积比分别为0.5～2%蛋白胨、0.25～1%酵母粉、0.3～1%琥珀酸、0.2～0.4%甘氨酸和0.1～0.5%葡萄糖组成，其pH值为6.0～6.3；发酵培养基最开始用10～20%体积分数的稀硫酸，将pH控制在5.8～6.0； 步骤(5).当菌体生长至5～6小时后，将发酵罐的搅拌转速调为0，发酵液中溶氧值随之变为0，维持30～75min的厌氧发酵后恢复发酵罐的搅拌转速； 所述的发酵液，在二级种子接种4～8h后通过反馈流加补料培养基，将发酵液的pH调为6.1～6.3； 所述的补料培养基体积为800～1100ml，且含有70～90g琥珀酸和50～70g甘氨酸； 步骤(6).当菌体密度OD600达到3～10时，分批补加5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂； 所述的5-氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂为3～5g/L D-葡萄糖； 所述的步骤(1)中的保藏编号为CGMCC No.1939工程菌，分类命名：中文名为大肠埃希氏菌，拉丁文学名为Escherichia coli Rosetta(DE3)-pET28a-A.R.hemA。 【当前权利人】浙江大学; 苏州益安生物科技有限公司 【当前专利权人地址】浙江省杭州市西湖区浙大路38号; 江苏省苏州市苏州工业园区唯新路50号 【专利权人类型】公立; 有限责任公司 【统一社会信用代码】12100000470095016Q; 91320594795398138Q 【引证次数】3.0 【被引证次数】2 【自引次数】2.0 【他引次数】1.0 【被他引次数】2.0 【家族引证次数】3.0 【家族被引证次数】6

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