【摘要】 一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明包括以下步骤：(1)高效提取粗酶：确定从麦胚中提取粗酶的最佳方法；(2)硫酸铵沉淀和浓缩：将提取的粗酶液通过硫酸胺沉淀，并选用超滤膜对酶的盐析液进行浓缩，获得超滤液；(3)离子交换层析：采用离子交换层析纯化超滤液中的脂肪酶，得到较纯的小麦胚芽脂肪酶；(4)制备小麦胚芽脂肪酶的亲和介质；(5)吸附和洗脱：得到纯酶，纯度达到95%。本发明所提供的小麦胚芽脂肪酶高效提取方法，回收率高，纯度高。 【专利类型】发明授权 【申请人】江南大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品学院 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201210577803.4 【申请日】2012-12-27 【申请年份】2012 【公开公告号】CN103013951B 【公开公告日】2014-03-26 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN103013951B 【授权公告日】2014-03-26 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N9/20 【发明人】夏小乐; 辛瑜; 陈金花; 张玲; 王武 【主权项内容】1.一种提取纯化小麦胚芽脂肪酶的方法，其特征在于包括以下步骤： (1)高效提取粗酶：将小麦胚芽机械粉碎至100目，然后用含有表面活性剂、pH=7.0的磷酸钠缓冲液混合，小麦胚芽︰缓冲液质量比0.3-1︰1，混合振荡30min，控制与混合液质量比1︰1加入正己烷溶解除油，12000rpm室温离心10min后取上清，得粗酶液； 表面活性剂为Triton X-100，吐温-20，吐温-80或SDS中的一种； (2)硫酸铵沉淀和浓缩：将提取的粗酶液边搅拌边加入固体硫酸铵，使其中硫酸铵浓度为10%－15%，摇匀后静置，然后在转速4000rpm下离心10min，弃去上清，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，回收率大于90%；选用过滤分子量为10000－15000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩，获得超滤液； (3)离子交换层析：采用离子交换柱层析纯化步骤(2)所得超滤液中的脂肪酶，装柱后，用pH 8的0.05 mol/L磷酸钠缓冲液平衡；将超滤液上样，上样量为柱体积的2－3倍，以含有1mol/L的NaCl的pH 8的0.05 mol/L磷酸钠缓冲液线性或梯度洗脱，流速为 1-5 mL/min，出现两个洗脱峰，收集活性峰，用透析袋浓缩； 离子交换柱选用DEAE-sepharose，DEAE-纤维素，Q-sepharose或superQ-sepharose中的一种； (4)合成亲和介质：小麦胚芽脂肪酶亲和配体为苯甲嘧啶，层析介质是Sepharose、壳聚糖、硅胶或陶瓷颗粒中的一种；小麦胚芽脂肪酶亲和配体和由环氧氯丙烷活化后的层析介质通过和乙二胺、1, 3-丙二胺、1, 4-丁二胺、1, 6-己二胺中的一种作为间隔臂进行连接，合成亲和介质； (5)吸附和洗脱：将经过离子交换后步骤(3)收集的酶液用步骤(4)合成的亲和介质进行亲和吸附，亲和吸附的条件为 pH 6.5~8.0，电导率为5-10 ms/cm；然后采用清洗液冲洗吸附脂肪酶的亲和介质，清洗液冲洗条件为 pH 6.5~7.5，电导率5~10 ms/cm；最后用洗脱缓冲液洗脱亲和介质上吸附的酶，洗脱条件为 pH 3.0-4.5，得到纯酶，立即用0.1M Tris溶液中和至中性。 【当前权利人】江南大学 【当前专利权人地址】江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品学院 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】1210000071780177X1 【引证次数】4.0 【被引证次数】1 【自引次数】2.0 【他引次数】2.0 【被他引次数】1.0 【家族引证次数】4.0 【家族被引证次数】8

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