【摘要】 本发明公开了一种通过强化丙酮酸羧化途径促进α-酮戊二酸积累的方法，将于米根霉(Rhizopus oryzae)中编码丙酮酸羧化酶的基因RoPYC2过量表达于发酵法生产α-酮戊二酸的菌株Yarrowia lipolytica WSH-Z06中，获得了一株丙酮酸羧化酶活性提高的重组菌，其丙酮酸羧化酶活性提高了10.2倍(达到0.87U/mg protein)；以甘油为唯一碳源，发酵144h后，α-酮戊二酸产量达到47.2g/L，是出发菌株的1.3倍；丙酮酸产量降低到10.4g/L，是出发菌株的49.0％。本发明通过调控三羧酸循环的回补途径，成功实现了碳代谢流从丙酮酸节点流向α-酮戊二酸节点，在提高α-酮戊二酸产量的同时，减少了副产物-丙酮酸的生成。为今后利用代谢工程手段改造菌株促进目标产物过量积累提供了一定的借鉴意义。 【专利类型】发明授权 【申请人】江南大学; 宜兴协联生物化学有限公司 【申请人类型】企业,学校 【申请人地址】214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201210066444.6 【申请日】2012-03-14 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102586128B 【公开公告日】2014-04-09 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102586128B 【授权公告日】2014-04-09 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N1/19; C12N15/60; C12P7/50; C12R1/645 【发明人】陈坚; 周景文; 殷晓霞; 堵国成; 李江华; 胡志杰; 蒋小东; 孙福新 【主权项内容】1.一种应用酵母工程菌生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于采用酵母工程菌为出发菌株，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于28℃、200rpm条件下培养20-24h；按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28℃，200rpm条件下培养144h；所述酵母工程菌过量表达外源丙酮酸羧化酶基因，构建方法为根据Genbank : HM130700.1，用化学全合成方法获得米根霉(Rhizopusoryzae)丙酮酸羧化酶基因，克隆到表达载体后转化保藏编号为CCTCCNO：M207143的Y.lipolyticaWSH-Z06后得到所述酵母工程菌；1L种子培养基组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，斜面用琼脂20g，pH5.5，自来水定容至1L；1L发酵培养基组成为：甘油100g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1.2g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.1g，盐酸硫胺0.2μg，在摇瓶时添加碳酸钙20g，自来水定容至1L。 1.一种应用酵母工程菌生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于采用酵母工程菌为出发菌株，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于28℃、200rpm条件下培养20-24h；按10%的接种量将培养好的种子接入发酵培养基，28℃，200rpm条件下培养144h；所述酵母工程菌过量表达外源丙酮酸羧化酶基因，构建方法为根据Genbank : HM130700.1，用化学全合成方法获得米根霉(Rhizopusoryzae)丙酮酸羧化酶基因，克隆到表达载体后转化保藏编号为CCTCCNO：M207143的Y.lipolyticaWSH-Z06后得到所述酵母工程菌；1L种子培养基组成为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾1g，七水硫酸镁0.5g，斜面用琼脂20g，pH5.5，自来水定容至1L；1L发酵培养基组成为：甘油100g，硫酸铵3g，磷酸二氢钾3g，七水硫酸镁1.2g，氯化钠0.5g，磷酸氢二钾0.1g，盐酸硫胺0.2μg，在摇瓶时添加碳酸钙20g，自来水定容至1L。 【当前权利人】江南大学; 江苏国信协联能源有限公司 【当前专利权人地址】江苏省无锡市蠡湖大道1800号; 江苏省无锡市宜兴经济开发区热电路1号 【专利权人类型】公立; 有限责任公司 【统一社会信用代码】1210000071780177X1; 【引证次数】2.0 【被引证次数】2 【自引次数】2.0 【被他引次数】2.0 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】12

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