【摘要】 本发明涉及脐带全细胞分离、冻存和复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤：对脐带组织进行消毒和清洗；将组织剪成块状，消化处理1.5小时；配制脐带组织冻存液备用；将消化处理得到的全细胞和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再在-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用；需要时将脐带全细胞从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗，复苏的脐带全细胞可通过细胞培养和细胞传代扩增间充质干细胞。本发明方法可有效保护冻存脐带组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。 【专利类型】发明授权 【申请人】博雅干细胞科技有限公司 【申请人类型】企业 【申请人地址】214092 江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201210159919.6 【申请日】2012-05-21 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102660502B 【公开公告日】2014-04-09 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102660502B 【授权公告日】2014-04-09 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N5/0775; C12N5/073; A01N1/02 【发明人】林卓衡; 陈俊峯; 朱业峰; 周丹 【主权项内容】1.处理脐带全细胞的方法，该方法包括：(A)以下对脐带离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤：(1)消毒和清洗：用消毒液酒精对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过PBS缓冲液清洗脐带组织，以减少脐带组织上的红细胞；(2)消化处理：将步骤(1)得到的脐带组织剪成组织块，将组织块放入消化酶溶液中，消化处理1.5小时，过滤清除组织块，加入间充质干细胞培养基以终止消化，然后对消化得到的细胞进行细胞清洗；(3)配制脐带全细胞冻存液：所述脐带全细胞冻存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的DMSO，配好的冻存液放在1℃至7℃的温度条件下低温冷藏；(4)脐带全细胞冻存：在1℃至7℃的低温环境下，将步骤(3)得到的全细胞冻存液加入到步骤(2)得到的清洗后的细胞中以重悬细胞，然后将重悬细胞加入冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再在-80℃的温度条件下冷冻1天，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；(B)以下对冻存的脐带离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤：(5)冻存脐带全细胞复苏：将步骤(4)冷冻的脐带全细胞从液氮中取出，解冻至20%-70%冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，以使冻存的脐带全细胞复苏；(C)以下对复苏的脐带全细胞进行间充质干细胞分离和扩增的步骤：(6)细胞培养：向步骤(5)得到的细胞中补加1-6倍细胞悬液体积量的间充质干细胞培养基，放入培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第2-7天时将培养容器从培养箱中取出，补加0.2-2倍细胞液体积量的间充质干细胞培养基，继续培养，在第9天时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次全换液，继续培养，往后每2天进行一次全换液；(7)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到40%-70%，利用消化酶TrypLeExpress将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天换液一次，直 至融合率达到70-90%后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；以及(D)下列步骤：(8)对步骤(7)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(9)将步骤(7)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冷冻，备用，其中，步骤(2)中所述消化酶溶液是将0.1g的I型胶原酶加入到100ml的DMEM-F12中，混匀，过滤得到的，所述间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin和84重量份的DMEM-F12。 【当前权利人】博雅干细胞科技有限公司 【当前专利权人地址】江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号 【专利权人类型】有限责任公司 【统一社会信用代码】91320211553793530T 【引证次数】4.0 【他引次数】4.0 【家族引证次数】7.0 【家族被引证次数】19

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