【摘要】 本发明涉及一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法。该方法首先基于已知的棉花抗病基因保守结构域序列设计抗性基因同源序列引物，然后以接种黄萎病病原菌后及未接种对照的棉花基因组DNA为材料，进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析，得到受黄萎病原菌诱导的多态性条带，再对所得到的多态性条带进一步回收、扩增、克隆、测序，对测序得到的序列与已知的抗病反应基因进行同源性比对，与已知的抗病反应基因高度同源的序列即为候选抗黄萎病基因序列。该方法通用性高，选择目的性高，操作相对简便，可以高效提供丰富的棉花候选抗黄萎病基因序列信息。 【专利类型】发明授权 【申请人】中国农业科学院棉花研究所 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】455000 河南省安阳市开发区黄河大道28号 【申请人地区】中国 【申请人城市】安阳市 【申请号】CN201210511335.0 【申请日】2012-12-04 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102965367B 【公开公告日】2014-06-18 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102965367B 【授权公告日】2014-06-18 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N15/10 【发明人】王红梅; 赵云雷; 陈伟; 李运海; 龚海燕; 桑晓慧 【主权项内容】一种获得棉花候选抗黄萎病基因序列的方法，该方法包括：(1)根据已克隆的棉花抗病基因保守结构域序列设计抗性基因同源序列引物；所述抗性基因同源序列引物为SEQIDNO : 39～SEQIDNO : 138所示；(2)提取接种黄萎病病原菌后24h～48h之间的棉花植株基因组DNA，以未接种黄萎病病原菌或接种清水的棉花基因组DNA为对照，进行抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析，得到受黄萎病病菌诱导的多态性条带；所述的抗性基因同源序列引物锚定的甲基化敏感扩增多态性分析为：(a)采用一组限制性内切酶HpaII+EcoRI对供试材料基因组DNA进行双酶切，将所得的酶切产物与接头连接；(b)将上述步骤(a)获得的连接产物作为预扩增模版，使用预扩增引物进行PCR扩增；(c)将上述步骤(b)获得的预扩增产物作为选择性扩增模版，进行选择性扩增，在选择性扩增中所使用的引物分为三组：抗性基因同源序列引物、EcoRI选择性扩增引物和HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物，所述EcoRⅠ选择性扩增引物和HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物都是在常规甲基化敏感扩增多态性分析中所用的选择性扩增引物；将任一抗性基因同源序列引物与任一EcoRⅠ选择性扩增引物组合成引物对，将任一抗性基因同源序列引物与任一HpaⅡ/MspⅠ选择性扩增引物组合成引物对，分别使用上述两种引物对组合来进行PCR扩增；(d)将上述步骤(c)获得的选择性扩增产物经过电泳分离、染色后进行谱带的观察，统计分析受黄萎病病原菌诱导的多态性条带和扩增出受黄萎病病原菌诱导的多态性条带时所用的引物对；(3)回收上述步骤(2)中所述受黄萎病病原菌诱导的多态性条带，并进行PCR扩增、克隆、测序；(4)将测定的序列与已知的抗病反应基因进行同源性比对，与已知的抗病反应基因高度同源的序列即为候选抗黄萎病基因序列。 【当前权利人】中国农业科学院棉花研究所 【当前专利权人地址】河南省安阳市开发区黄河大道28号 【统一社会信用代码】121000004173473256 【家族被引证次数】3

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