【摘要】 本发明的目的就是提供一种四环素产生菌原生质体的制备、再生方法。它包括如下步骤：a、制备四环素斜面培养基；b、制备孢子悬浮液；c、制备菌丝体培养基；d、制备再生培养基；e、培养菌丝体；f、酶解细胞壁；g、分离原生质体；h、原生质体再生。本发明提供的四环素菌种选育的新方法，解决了四环素原生质体菌落无法再生和产孢子能力低、不能传代的问题。 【专利类型】发明授权 【申请人】华北制药股份有限公司 【申请人类型】企业 【申请人地址】050015 河北省石家庄市和平东路388号 【申请人地区】中国 【申请人城市】石家庄市 【申请人区县】长安区 【申请号】CN201210592699.6 【申请日】2012-12-29 【申请年份】2012 【公开公告号】CN103060235B 【公开公告日】2014-08-27 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN103060235B 【授权公告日】2014-08-27 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N1/20; C12R1/485 【发明人】张彩霞; 张曦 【主权项内容】1.一种四环素产生菌原生质体的制备与再生方法，其特征在于它包括如下步骤：a、制备四环素斜面培养基：称取小麦麸皮3.0-3.5 g，硫酸镁0.004-0.006 g，磷酸氢二钾0.01-0.12 g，磷酸氢二铵0.013-0.015g，琼脂粉1.3-1.5 g，加蒸馏水至100ml；120-124℃条件下湿热灭菌30分钟；斜面培养基装量60ml/茄子瓶；b、制备孢子悬浮液：将四环素产生菌接种于斜面培养基上，于33-36℃条件下培养96小时左右，长出斜面孢子；在无菌条件下加入无菌蒸馏水或菌丝体培养基制成孢子悬浮液，使孢子悬浮液浓度在1×108/ml以上；c、制备菌丝体培养基：称取葡萄糖0.8-1.2 g，蛋白胨0.3-0.5 g，酵母膏0.3-0.5 g，磷酸二氢钾0.1-0.2 g，硫酸镁0.03-0.05 g，磷酸氢二钾0.3-0.4 g，甘氨酸0.2-1 g，加水至100ml；120-124℃条件下湿热灭菌30分钟；d、制备再生培养基：由体积比为1 : 1的蒸馏水和饮用水配制而成，以100ml再生培养基总体积计，其中含有以下组分：面粉2g，蛋白胨0.05g，磷酸二氢钾0.08g，碳酸钙0.1g，蔗糖2g，琼脂2.2g；灭菌条件：121℃，30分钟；e、培养菌丝体：将四环素孢子悬浮液接种于c步骤所述菌丝体培养基中，在27℃-33℃条件下，震荡培养22-32小时，离心弃去上清液，得到菌丝体；f、酶解细胞壁：将e步骤所得菌丝体加入稳定液，离心洗涤2-4次，加入溶菌酶溶液，使溶菌酶作用浓度为2 mg/ml-6 mg/ml，30℃-37℃酶解1-3小时，得到酶解液；g、分离原生质体：酶解液经离心去除沉淀，然后再将上清液离心，获得原生质体；h、原生质体再生：将g步骤所得的原生质体用稳定液离心洗涤2-4次后，加入稳定液制成原生质体悬浮液，原生质体悬浮液用稳定液稀释，采用夹层法培养于再生培养基上，于33℃-36℃条件下培养5-7天，形成再生菌落。 【当前权利人】华北制药股份有限公司 【当前专利权人地址】河北省石家庄市和平东路388号 【专利权人类型】其他股份有限公司(上市) 【统一社会信用代码】91130100104397700P 【引证次数】1.0 【他引次数】1.0 【家族引证次数】1.0

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