【摘要】 本发明公开了一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的检测方法，即首次采用生物发光共振能量转移技术和化学发光技术免疫检测O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性：将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0~40℃孵育30~60min，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0~40℃孵育30~60min，然后再加入荧光素底物，4~30℃下静置5~30min，检测670nm处的发光强度，进而计算获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；本发明方法操作简便，应用范围广，避免了外源激发光所引起的散射和样品基质荧光等本底的干扰，具有更高的灵敏度和准确度。 【专利类型】发明授权 【申请人】杭州师范大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】310036 浙江省杭州市下沙高教园区学林街16号 【申请人地区】中国 【申请人城市】杭州市 【申请人区县】上城区 【申请号】CN201210202062.1 【申请日】2012-06-15 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102798717B 【公开公告日】2014-11-26 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102798717B 【授权公告日】2014-11-26 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】G01N33/573 【发明人】陈灿玉; 梁媛媛; 吕常庆; 张现侠; 黄志坚; 章鹏飞 【主权项内容】 1.一种O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性检测方法，其特征在于所述方法为：(1)将O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶与生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤反应，获得生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶；(2)将链亲和素-荧光素酶融合蛋白与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶在0～40℃孵育30～60min，使链亲和素-荧光素酶融合蛋白中的链亲和素与生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶中的生物素结合，形成O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，再加入荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体，0～40℃孵育30～60min，使荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物一端的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶结合，形成荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体-O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物，然后再加入荧光素底物，4～30℃下静置5～30min，使荧光染料标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶抗体-O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶-生物素与链亲和素结合体-荧光素酶融合蛋白复合物中的荧光素酶融合蛋白与荧光素底物反应产生发光物质，检测670nm处的发光强度，根据生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶浓度与所述发光强度的相关标准曲线计算出生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶的含量，进而根据酶活定义获得O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性；所述O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶活性的定义为：在37℃条件下，1min内能转化生物素标记的O6-苄基鸟嘌呤生成1微摩尔的生物素标记的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶所需的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶酶量为一个酶活单位。 【当前权利人】杭州师范大学 【当前专利权人地址】浙江省杭州市下沙高教园区学林街16号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12330100470103303W 【引证次数】6.0 【被引证次数】1 【他引次数】6.0 【被他引次数】1.0 【家族引证次数】6.0 【家族被引证次数】5

未经允许不得转载：http://www.zhongzhencnc.com/1791491623.html