【摘要】 本发明涉及一种转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，首先，将绿色荧光蛋白(GFP)与潮霉素磷酸转移酶(HPT)克隆于标记基因载体，目的基因置于另一T-DNA载体，携带标记基因载体的农杆菌菌株与携带目的基因载体的农杆菌菌株混合并转化水稻愈伤组织，利用特异引物对目的基因载体的抗病基因进行PCR检测，筛选获得共转化植株(T0)。然后，在共转化植株的分离世代(T1或T2)，借助于台灯式荧光检测器，大量、快速地筛除GFP阳性的标记基因植株，并对GFP阴性植株进行抗病基因的PCR检测，从而获得转抗病基因的无选择标记个体。本发明可以应用于水稻抗稻瘟病基因或其它功能基因的无选择标记转基因育种，提高水稻抗病能力或改良其它农艺性状。 【专利类型】发明授权 【申请人】浙江省农业科学院 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】310021 浙江省杭州市石桥路198号 【申请人地区】中国 【申请人城市】杭州市 【申请人区县】上城区 【申请号】CN201210223328.0 【申请日】2012-06-27 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102703499B 【公开公告日】2014-02-12 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102703499B 【授权公告日】2014-02-12 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N15/82 【发明人】瞿绍洪; 李军; 王歆; 赵建华; 何海燕; 刘中来 【主权项内容】一种转化水稻抗病基因并获得无选择标记转基因后代的方法，包含以下步骤：1)将绿色荧光蛋白GFP与潮霉素磷酸转移酶HPT克隆于标记基因载体，目的基因水稻抗稻瘟病基因Pi9置于另一T-DNA载体；2)携带标记基因载体的农杆菌菌株与携带目的基因载体的农杆菌菌株混合并转化水稻愈伤组织；3)通过绿色荧光检测确认，从GFP阳性的T0植株取叶组织，提取水稻基因组DNA，利用目的基因水稻抗稻瘟病基因Pi9的特异引物进行PCR分析，筛选含Pi9的共转化水稻植株Pi9+HPT+GFP+，其中PCR分析方法具体为：根据目的基因载体抗病基因序列及其两侧的T-DNA序列，设计了多套PCR引物，分别在T-DNA边界序列与抗病基因上游或下游序列之间进行扩增，从而对目的基因进行有效检测，其中Pi9上游序列的扩增，采用T-DNA右边界RB附近载体序列的同源引物RB-1，其序列为5'-CGCTCTTTTCTTAGGTTTACC-3'，和Pi9基因5'序列的同源引物Pi9-1，其序列为5'-AACCGTAAGTAGTATAGCATAGCT-3'，或采用RB-2，其序列为5'-ATATCCTGTCAAACACTGATAGT-3'，和Pi9-1；Pi9下游序列的扩增，采用Pi9基因3'序列的同源引物Pi9-2，其序列为5'-TCTTTGGACATATGCATGGACC-3'，和T-DNA左边界LB附近载体序列的同源引物LB-1，其序列为5'-GTAAACAAATTGACGCTTAGACAAC-3'，或采用Pi9-3，其序列为5'-TGTATATTCTGGCCTTGTTTAGTT-3'，和LB-2，其序列为5'-ATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGA-3'；4)在共转化植株的分离世代T1或T2的发芽种子，借助于台灯式荧光检测器，筛除GFP阳性的标记基因植株，并对GFP阴性植株进行抗病基因的PCR检测，从而获得转抗病基因的无选择标记个体。 【当前权利人】浙江省农业科学院 【当前专利权人地址】浙江省杭州市石桥路198号 【统一社会信用代码】12330000470001585G 【引证次数】1.0 【他引次数】1.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】11

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