【摘要】 本发明涉及分子生物学领域，本发明具体涉及利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法。所述方法包括步骤：1)棉株叶片的选取；2)高分子量细胞核DNA的提取；3)高分子量DNA的部分消化及两次选择；4)大片段DNA的回收、连接及转化；5)插入片段的检测。该方法适用于构建所有棉花材料的BAC文库，包括种子量少或无种子但宿生保存的棉花材料。 【专利类型】发明授权 【申请人】中国农业科学院棉花研究所 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】455000 河南省安阳市开发区黄河大道38号 【申请人地区】中国 【申请人城市】安阳市 【申请号】CN201210215857.6 【申请日】2012-06-28 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102747427B 【公开公告日】2014-06-25 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102747427B 【授权公告日】2014-06-25 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C40B50/06; C12N15/10; C12N15/63 【发明人】高海燕; 王坤波; 马峙英; 刘方; 王省芬; 王春英; 张香娣; 王玉红; 彭仁海 【主权项内容】1.利用非暗培养叶片构建棉花BAC文库的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)棉株叶片的收集：选用不需要暗处理的棉株的叶片，摘取田间或花盆正常生长、刚平展的幼嫩棉花叶片；2)提取高分子量细胞核DNA，将细胞核包埋在低熔点琼脂糖中，然后裂解释放核DNA，具体步骤如下：取叶片40g，迅速转入液氮中研磨约1h，然后将粉末转入400mL预冷的Washbuffer，配方为：0.08M KCl，0.01M Trizma base，0.01M EDTA Na2，1mM Spermidine，1mM Spermine，0.5M Sucrose，2%PVP40，0.13%DIECA，0.15%β–巯基乙醇和0.5%TritonX-100，冰上轻轻搅拌15-20min，用两层纱布和2层微细滤布过滤到预冷的50mL离心管中，4℃、3200rpm、离心20min，去除上清，如果此次离心沉淀时还有一些绿色沉淀，用毛刷将表层的绿色沉淀轻轻刷出，然后用Wash buffer对沉淀再次悬浮，并且降低离心速度，去除绿色沉淀；向沉淀中加入500μL1×HB，配方为：0.08M KCl，0.01M Trizma base，0.01MEDTA Na2，1mM Spermidine，1mM Spermine，0.5M Sucrose，2%PVP40，0.13%DIECA，0.15%β–巯基乙醇，悬浮沉淀，合并各离心管的悬浮液于一个离心管中，向离心管中加满1×HB混匀，4℃、4000rpm、离心15min，用1×HB重复此步骤3次，最后在沉淀中加入不含β–巯基乙醇的1×HB调整细胞核的浓度，将细胞核悬浮液和1.5%的低熔点琼脂糖于45℃水浴5min，然后两者等体积混匀，45℃水浴5min，迅速将混合液加入plug mold中，冰上冷却30min，待其充分凝固后，将胶块放入含有蛋白酶K的裂解液中，蛋白酶K的浓度为1mg/mL，在50℃杂交炉中裂解36h，中间换一次裂解液，去除裂解液，加入含浓度PMSF的50mL预冷的T10E10，其中PMSF的浓度为1mM，T10E10的配方为10mM Tris-HCl、10mM EDTA，冰上轻轻震荡2次，每次1h，再将胶块放在不含PMSF的T10E1中冰上清洗4次，其中，T10E1的配方为10mM Tris-HCl、1mM EDTA，每次1h，随后将胶块置于T10E1中，4℃保存备用；3)高分子量核DNA的酶切及两次选择，采用脉冲场凝胶电泳分离，对于第一次选择：脉冲的起始时间10s，第一次选择中，脉冲条件为：1%琼脂糖，0.5×TBE缓冲液，11℃，泵70，角度120°，6v/cm，10s-50s，18h，选出120～300kb的DNA片段，分成120～200kb和200～300kb两个范围进行第二次选择，对于第二次选择：起始和终止时间分别为4s-4s，第二次选择中，脉冲条件为：1%琼脂糖，0.5×TBE缓冲液，11℃，泵70，角度120°，6V/cm，电泳时间14h，选出120～200kb和200～300kb的DNA片段；4)分别对存在于胶块中的120～200kb，200～300kbDNA进行回收，与载体连接，然后转化感受态细胞；5)检测阳性克隆的插入片段是否满足实验需要。 【当前权利人】中国农业科学院棉花研究所 【当前专利权人地址】河南省安阳市开发区黄河大道38号 【统一社会信用代码】121000004173473256 【家族被引证次数】6

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