【摘要】 本发明属于微生物领域，提供了一种双歧杆菌原生质体的制备与转化方法，将长双杆菌接种到MRS琼脂培养基厌氧培养，转种于MRS液体培养基中培养后以2.5-3.5%的接种量转接于新鲜MRS液体培养基中，36-38℃，厌氧培养18-20h；收集菌体，重悬；加变溶菌素至终浓度为4.5-5.5mg/L，36-38℃酶解25-35分钟；重悬于SMM溶液中，得到双歧杆菌原生质体。该方法制备的原生质体生成率达到81％，其再生率达到48％，可以应用于双歧杆菌的转化，引入外源基因，构建双歧杆菌的工程菌株。 【专利类型】发明授权 【申请人】南昌大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】330031 江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号 【申请人地区】中国 【申请人城市】南昌市 【申请人区县】新建区 【申请号】CN201210045286.6 【申请日】2012-02-27 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102816711B 【公开公告日】2014-07-16 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102816711B 【授权公告日】2014-07-16 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N1/20; C12N15/74; C12N1/21 【发明人】万翠香; 魏华; 夏慧玲; 章昭琳; 熊勇华; 许恒毅; 徐锋; 赖卫华; 王报贵 【主权项内容】1.一种双歧杆菌原生质体的转化方法, 其特征是，包括以下步骤 : (1)将双歧杆菌接种到 MRS琼脂培养基上，厌氧培养；(2)从MRS琼脂培养基上挑单菌落，接种于 MRS液体培养基中，厌氧培养；(3)将上述培养后的MRS液体培养基以2.5－3.5%v/v的接种量转接于新鲜的MRS液体培养基中，36—38 ℃，厌氧培养18—20 h；离心收集菌体，用 SMM溶液重悬；(4)加变溶菌素至终浓度为4.5—5.5 mg/L，36-38℃酶解，酶解时间为25－35分钟；酶解结束后重悬于SMM溶液中，得到双歧杆菌原生质体； (5)构建穿梭表达载体；(6)在步骤(4)制备到的双歧杆菌的原生质体中加入冰预冷的穿梭表达载体；(7)加入40－45 ℃预热的浓度为38－42% 的PEG6000溶液，40－45℃融合8－12min；立即加入SMMP溶液洗涤，所述SMMP溶液为液体再生培养基与SMM溶液体积比为2－4 : 1的混合溶液；(8)再加入SMMP溶液复苏 0.8－1.2小时；复苏之后将菌液涂布在氨苄青霉素抗性的固体再生培养基上培养2-3 天，得到转化后平板上的双歧杆菌菌落。 【当前权利人】南昌大学 【当前专利权人地址】江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12360000491015556U 【引证次数】1.0 【他引次数】1.0 【家族引证次数】1.0

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