【摘要】 本发明公开一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂及其检测方法。即将已知系列浓度吡喹酮标准品和吡喹酮抗血清进行抗原抗体反应，得出吸光度值，制作成标准曲线，同时将待测动物源性食品的提取液及吡喹酮抗血清进行抗原抗体结合反应后，根据吸光度值在吡喹酮标准曲线上查找到相应的位置，从而计算出动物源性食品中吡喹酮准确的含量。本发明的一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒检测线性范围为250ng—7.8ng/g(ml), 与结构类似化合物喹稀酮、吡蚜酮无交叉反应，检测方法可靠、操作简便、检测效率高，稳定性能好，有利于基层单位的使用。 【专利类型】发明授权 【申请人】镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 【申请人类型】机关团体 【申请人地址】212000 江苏省镇江市东吴路84号 【申请人地区】中国 【申请人城市】镇江市 【申请人区县】京口区 【申请号】CN201210304592.7 【申请日】2012-08-24 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102854309B 【公开公告日】2014-09-10 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102854309B 【授权公告日】2014-09-10 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】G01N33/545 【发明人】肖震; 李平; 周成林; 周洪斌; 吴小华 【主权项内容】1.一种动物源性食品中吡喹酮含量的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于含有以下组分：(1)、吡喹酮标准溶液：(2)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体溶液；(3)、吡喹酮抗血清；(4)、浓缩洗涤液；(5)、显色液；(6)、终止液；(7)、已包被有包被抗原吡喹酮胺-OVA的聚苯乙烯微量反应板；(8)、空白聚苯乙烯微量反应板；所述的吡喹酮抗血清通过如下方法制备，其制备过程具体包括如下步骤：①、10mg吡喹酮加入0.15ml1N HCl中，油浴升温至120℃回流反应3h，反应结束后，冷却放置，待底部油状物固化后，倒出上层水层，用NaHCO3调节pH至9.0，二氯甲烷萃取该水相3次，每次40ml；无水硫酸钠干燥，旋转蒸发得到产物；②、将4-氨基环己烷羧酸10mg, 和Na2CO312mg, 溶解到75ml蒸馏水中，然后滴加苄氧基羰酰氯16mg，在室温下剧烈搅拌3h至产生沉淀，以3号砂芯漏斗过滤分离出的沉淀，以乙醚洗涤3次，然后溶入100ml1N HCl中，先以0.15ml乙醚提取1次，再用乙醚提取2次，每次乙醚100ml；合并提取物以1NHCl洗3次，每次1NHCl50ml；过无水Na2SO4柱脱水，50℃真空浓缩至干得白色粉末；③、取步骤①所得的产物0.5mg与步骤②所得的白色粉末0.72mg用30ml二氯甲烷溶解，再加入0.76mg环已基碳二亚胺，0.39mg4-(N, N-二甲基氨基)吡啶, 常温反应过夜，反应结束后生成白色固体，抽滤，所得的滤液用10ml1N HCl洗涤，再旋转蒸发得黄色固体，用甲醇：二氯甲烷为1：10的展开剂进行薄层板分离纯化；④、将步骤③所得的黄色固体经薄层分离纯化后的产物0.5mg，钯碳0.2mg，置于圆底烧瓶中，抽真空，充氢气；加入15ml甲醇, 常温反应2-3h，过滤去除钯碳，以甲醇：二氯甲烷为1：10的展开剂进行薄层板分离纯化得到吡喹酮铵；⑤、免疫原的制备称取0.01mg BSA溶于1ml，浓度为100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中，再加入0.01mg丁二酸酐，常温反应3h；上述常温反应3h后的产物用500ml，浓度为100mM，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液透析3天，透析3次，每4h更换缓冲液；在上述透析后的产物中加入0.004mg碳二亚胺盐酸盐和0.004mgN-羟基琥珀酰亚胺, 再加入步骤④所得的吡喹酮胺0.008mg，4℃反应3h；上述4℃反应3h后的产物用含8mg氯化钠的1000ml，浓度为10mM，pH7.0的磷酸盐缓冲溶液透析3天，透析3次；透析好的产物即为免疫原即吡喹酮胺-BSA；⑥、吡喹酮抗血清制备选用临床健康，体重1.5—2Kg的新西兰雄性兔4只，第一次免疫用1ml弗氏完全佐剂加1ml步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA皮下或皮内多点注射，此后每间隔四周用1ml弗氏不完全佐剂加1ml步骤⑤所得的免疫原即吡喹酮胺-BSA，前后共免疫5次，最后一次免疫后10天宰杀，采血，分离出血清即得吡喹酮抗血清。 【当前权利人】镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 【当前专利权人地址】江苏省镇江市东吴路84号 【引证次数】3.0 【他引次数】3.0 【家族引证次数】3.0 【家族被引证次数】2

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