【摘要】 本发明是一种缢蛏抗菌肽基因的PCR重组制备抗菌肽的方法，它以缢蛏血窦淋巴细胞为材料，从中提取总RNA，设计特异引物，采用嵌套PCR方法，获得258bp大小的scp基因，将其插入pPICZαA表达载体，转入毕赤酵母GS115，得到表达菌株LGS-3，通过表达条件优化，获得其最佳表达条件为温度28℃，甲醇浓度1%，诱导表达时间为72h。诱导表达的产物抗菌肽对凡隆气单胞菌具有较强的抑制活性。将其应用于泥鳅养殖，饲料中添加0.5%的抗菌肽制剂，可使泥鳅在投放凡隆气单胞菌的情况下存活率提高48%左右，产量的增加28.55%左右。 【专利类型】发明授权 【申请人】淮海工学院 【申请人类型】学校 【申请人地址】222000 江苏省连云港市新浦区苍梧路59号淮海工学院海洋学院李联泰转 【申请人地区】中国 【申请人城市】连云港市 【申请人区县】海州区 【申请号】CN201210547250.8 【申请日】2012-12-17 【申请年份】2012 【公开公告号】CN103045604B 【公开公告日】2014-05-14 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN103045604B 【授权公告日】2014-05-14 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N15/12; C12N15/81; C07K14/435; A23K1/17; A23K20/195 【发明人】李联泰; 安贤惠; 朱明 【主权项内容】1.一种制备缢蛏抗菌肽的方法，其特征在于，其步骤如下：(1)收集缢蛏血淋巴10mL，4℃、4000rpm下离心25min得到血淋巴细胞，弃上清液，收集沉淀物于1.5mL RNase-free的EP管，加入1mL Trizol，吹打混匀后室温静置5min，每管加500μL氯仿，振摇30s，冰浴3min，然后在4℃，12000rpm下离心15min，吸取上清液，转移至另外一支RNase-free的EP管，用体积比为24：1的氯仿：异戊醇抽提至无蛋白沉淀，吸取上清液，加4℃预冷的500μL异丙醇，混匀，冰上静置l0min，4℃，12000rpm离心15min，弃上清；加1mL4℃预冷的75%乙醇洗一次，4℃，8000rpm离心5min，倒掉乙醇，室温倒置15min，加10mL DEPC处理水溶解，得缢蛏总RNA样品，置于4℃冷藏；(2)按下述方法对缢蛏总RNA样品进行PCR扩增：a.反转录cDNA合成体系建立：取20μl缢蛏总RNA样品70℃下温育10min，迅速冰上冷却，得到变性总RNA，备用；按下述方法建立反转录cDNA合成体系：将上述体积的试剂混匀，42℃温育60min，95℃变性5min，然后4℃放置5min；b.嵌套PCR①第一次PCR反应体系：第一次PCR反应程序②第二次PCR反应体系第二次PCR反应程序所述的引物分别为：M13-MGDs 5'-ACAATTTCACACAGGAGATTGAGGTG-3；锚定引物1 5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTC-3'；锚定引物2 5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTG-3'；锚定引物3 5'-ACGACTCACTATAGGGTTTTTTTTTTTTA-3’；M13 5'-ACAATTTCACACAGGA-3'；T7 5'-ACGACTCACTATAGGG-3'；(3)对3’RACE扩增产物进行切胶回收，与pMD18-T载体连接后，转化E.coli DH5α，长出菌落后，筛选阳性转化子，测序得到PCR产物基因序列，命名为scp基因；(4)酵母表达载体构建：在scp基因两端加上酶切位点EcoRI和XbaI，正向引物SCPF : 5'-CGGAATTCATGAAGACATTCAGT-3'，下划线为EcoRI酶切位点，反向引物SCPR : 5'-GCTCTAGAGGATCCCCGGGTACC-3'，下划线为XbaI酶切位点，从阳性转化子中扩增scp基因，再与pMD18-T载体连接后，筛选获得阳性转化子，提取质粒，用EcoRI和XbaI酶切，切胶回收带有酶切位点的scp基因片段，和同样用EcoRI和XbaI酶切的质粒载体pPICZαA按10 : 1的摩尔比进行连接，转化至E.coli DH5α中，用含25μg/mL Zeocin的LB平板筛选阳性转化子，提取表达载体质粒；(5)转化及PCR验证：用Bst I酶切线性化重组表达载体质粒，与酵母表达宿主GS115感受态细胞混匀，在1.5kv，25μF，200Ω，5msec条件下电击，立刻加入1M山梨醇1mL，混匀后吸取100μL涂于含100mg/L Zeocin抗生素的MD平板，30℃培养，直至长出酵母重组子菌落LGS-3；提取LGS-3的DNA，使用引物5'-AOX和3'-AOX以及SCPF和SCPR进行PCR验证；培养LGS-3菌液，按LGS-3菌液：30%甘油体积比1 : 1保存菌种；(6)重组蛋白的诱导表达：将LGS-3菌液接种于含50mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培养24h；离心弃上清，转接到含100mL BMMY的500mL三角瓶中，30℃，200rpm培养，离心，得到含抗菌肽的上清液；其中：MD培养基：13.4g/L无氨基酵母氮源，0.4mg/L生物素，20g/L葡萄糖，1.5%琼脂；BMGY/BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM pH6.0磷酸钾缓冲液，1.34%无氨基酵母氮源，0.4mg/L生物素，1%甘油，制备BMMY时用0.5%甲醇代替1%甘油；配置方法：取l0g酵母抽提物，20g蛋白胨，溶于700mL去离子水中，高压灭菌20min，冷却至室温，加入过滤除菌后的10×无氨基酵母氮源100mL，2mL500×生物素，100mL10×甘油，100mLl mol/L磷酸钾缓冲液，4℃保存备用。 【当前权利人】淮海工学院 【当前专利权人地址】江苏省连云港市新浦区苍梧路59号淮海工学院海洋学院李联泰转 【统一社会信用代码】12320000466007183X 【引证次数】1.0 【他引次数】1.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】7

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