【摘要】 本发明涉及螺旋藻开发应用技术，旨在提供一种制备螺旋藻双向电泳分析蛋白的方法。该方法是将螺旋藻细胞在-20℃冷冻1.5h后再在4℃融化1h，如此反复冻融5次完全破碎；用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，用SDS提取液从沉淀中提得水不溶性蛋白。本发明所建的螺旋藻2-DE分析蛋白制备方法——冻融破壁分步提纯法，与现有螺旋藻2-DE分析蛋白制备方法相比，具有操作简便、仪器设备简单、成本低廉和信息量更丰富等显著优点，可显著提升螺旋藻蛋白质2-DE图谱的信息量和分辨率，从而为后续蛋白质组学等生物信息学研究奠定了必要基础。 【专利类型】发明授权 【申请人】浙江大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号 【申请人地区】中国 【申请人城市】杭州市 【申请人区县】西湖区 【申请号】CN201210084120.5 【申请日】2012-03-27 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102645357B 【公开公告日】2014-11-19 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102645357B 【授权公告日】2014-11-19 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】G01N1/28 【发明人】汪志平; 王景梅; 蓝瑾瑾; 邵斌; 刘新颖; 于金鑫; 陈子元 【主权项内容】1.一种制备螺旋藻双向电泳分析蛋白的方法，其特征在于，是将螺旋藻细胞在-20℃冷冻1.5h后再在4℃融化1h，如此反复冻融5次完全破碎；用Tris-HCl提取液提取3次得到水溶性蛋白，用SDS提取液从沉淀中提得水不溶性蛋白； 所述Tris-HCl提取液的组成：125mM Tris-HCI，0.9％NaCl，pH6.8；所述SDS提取液的组成：64mM Tris-HCl提取液、10％甘油、2％SDS、5％β-巯基乙醇，pH6.8；各百分比为质量百分比关系； 所述的方法具体包括下述步骤： 取0.75g钝顶螺旋藻藻泥于5ml离心管中，并加入Tris-HCl提取液3ml，在-20℃冷冻1.5h后再在4℃融化1h，如此反复冻融5次至出现深蓝紫色荧光，并在显微镜下镜检无完整细胞； 4℃下12000r/min离心20min得上清液I-1；沉淀加入3ml Tris-HCl提取液轻轻摇匀后置于4℃15min，4℃下12000r/min离心20min得上清液I-2；如此再抽提1次得上清液I-3；合并上清液I-1～3即为螺旋藻水溶性蛋白； 在上清液I-3的沉淀中加入3ml SDS提取液并轻轻摇匀，4℃放置6h，每30min摇匀一次，4℃下12000r/min离心20min得上清液II，即为螺旋藻水不溶性蛋白； 在上述所提的水溶性蛋白和水不溶性蛋白中分别加入3倍体积预冷的含10％TCA和0.07％DTT的丙酮溶液，混匀后-20℃静置4h，4℃下12000r/min离心20min，弃上清液；沉淀中加入3ml含0.07％DTT的预冷丙酮溶液，洗涤后-20℃静置2h，4℃下12000r/min离心20min，弃上清液，如此反复抽提3次至上清液完全无色；沉淀经真空冷冻干燥，即制得用于螺旋藻双向电泳分析的水溶性蛋白和水不溶性蛋白。 【当前权利人】浙江大学 【当前专利权人地址】浙江省杭州市西湖区浙大路38号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12100000470095016Q 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】4

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