【摘要】 本发明提供了一种以沙鼠肌肉细胞作为病毒培养的基质细胞制备肠道病毒疫苗的方法。本发明选择沙鼠肌肉细胞作为培养EV71或CoxA16病毒的基质细胞，EV71或CoxA16病毒在此细胞上生长滴度高，可多次收液；此细胞可多次传代，可建立成肌细胞株，用于疫苗的生产，节约沙鼠的消耗；它是原代细胞，不存在传代细胞DNA难以处理等问题，制备疫苗生产工艺相对简单，纯化方便，所制备的疫苗对婴幼儿接种，更安全、可靠。 【专利类型】发明授权 【申请人】浙江省疾病预防控制中心 【申请人类型】机关团体 【申请人地址】310051 浙江省杭州市滨江区滨盛路3399号 【申请人地区】中国 【申请人城市】杭州市 【申请人区县】滨江区 【申请号】CN201210127077.6 【申请日】2012-04-26 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102657858B 【公开公告日】2014-08-13 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102657858B 【授权公告日】2014-08-13 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】A61K39/125; A61K39/295; A61P31/14; C12N5/071 【发明人】朱函坪; 朱智勇; 夏时畅; 钱磊; 徐芳; 姚苹苹; 杨章女; 谢荣辉; 周小龙 【主权项内容】一种肠道病毒疫苗的制备方法，所述方法包括：(1)取10～15天龄的沙鼠，处死，无菌取下肌肉组织，剪碎，以含100U/ml卡那霉素的细胞培养液洗2次，去尽洗液；(2)加肌肉组织10倍质量的含0.2%胶原酶II、0.25%胰蛋白酶的消化液，4℃消化过夜；(3)终止消化后弃消化液，加质量为肌肉组织质量10倍的细胞培养液反复吹打，分散细胞，依次过100、200和400目的不锈钢滤网，收集滤液，离心，弃上清液，沉淀细胞用细胞培养液重新悬浮，加新生牛血清至其终浓度为10%，接种至细胞培养瓶，置36℃培养箱中培养；(4)差速贴壁2h后，将上清悬浮细胞转移至新的细胞培养瓶，36℃培养至细胞生长达到70%～80%融合时，换含5%新生牛血清的细胞培养液继续培养，当细胞达到95%融合时，用于病毒接种；(5)取95%融合的肌肉单层细胞培养瓶，弃培养液，接种病毒滴度为1×103.0～5×103.0TCID50的含肠道病毒的病毒液，置35℃培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，加含1%新生牛血清、100U/ml卡那霉素的细胞培养液，35℃培养至细胞出现病变，收获上清液；所述肠道病毒为肠道病毒EV71或CoxA16；(6)收获的上清液作为病毒液接种至新制备的95%融合的肌肉单层细胞，按步骤(5)重复操作4～5次，直至收获的上清液中病毒滴度大于1×106.0TCID50，离心去除细胞碎片，加10%新生牛血清，再加病毒液2倍体积量的脱脂牛奶，混匀，即为病毒毒种，分装后，-80℃保存备用；(7)取步骤(6)病毒毒种，接种至新制备的95%融合的肌肉单层细胞培养瓶，置35℃培养箱中使病毒吸附2h，弃病毒液，用细胞培养液洗3次，加含100U/ml卡那霉素的无牛血清的细胞培养液，35℃培养2～3天，收获病毒上清液；(8)所得病毒上清液灭活后，经10万分子量孔径的超滤膜浓缩，再过Sepharose或Sephacryl凝胶柱层析，收获第一峰，即为疫苗原液；疫苗原液经PBS稀释，稀释比例为1 : 160，按0.5%比例加人血白蛋白，得疫苗半成品，疫苗半成品再经检验、分装，即为疫苗成品；所述灭活采用β-丙内脂或甲醛，用于病毒灭活的β-丙内脂体积用量为收获病毒体积量的三千之一至五千之一，甲醛体积用量为收获病毒体积量的二千之一至四千之一；步骤(1)～(7)中，所述细胞培养液为MEM培养液。 【当前权利人】浙江省疾病预防控制中心 【当前专利权人地址】浙江省杭州市滨江区滨盛路3399号 【引证次数】4.0 【他引次数】4.0 【家族引证次数】4.0 【家族被引证次数】1

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