【摘要】 本发明公开了一种检测水体中弧菌的四色荧光PCR试剂盒及检测方法，采用了创新的细菌富集试剂技术、DNA提取试剂技术、特异性荧光探针杂交PCR检测技术以及多重PCR技术，样本无需增菌培养，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰，且一次能检测2种弧菌的4种种群。本发明的有益效果主要体现在：无需样本前增菌，细菌的检测敏感性高、特异性好，降低了常规PCR扩增的假阳性率；可实现同时对霍乱弧菌、副溶血弧菌的快速、准确、特异检测。 【专利类型】发明授权 【申请人】宁波检验检疫科学技术研究院 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】315012 浙江省宁波市海曙区马园路9号 【申请人地区】中国 【申请人城市】宁波市 【申请人区县】海曙区 【申请号】CN201210249902.X 【申请日】2012-07-19 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102816841B 【公开公告日】2014-01-29 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102816841B 【授权公告日】2014-01-29 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12Q1/68; C12R1/63 【发明人】周冬根; 王燕; 翟敏; 刘超群; 张升; 倪敏君; 李红 【主权项内容】1.一种检测水体中弧菌的四色荧光PCR试剂盒，包括浓度为5U/ul 的Taq DNA聚合酶、多重荧光PCR反应母液和DNA提取试剂，其特征在于还包括细菌富集试剂，所述细菌富集试剂含有质量百分终浓度为20%的PEG8000和终浓度为200mM的氯化钠，所述DNA提取试剂含有终浓度20mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸、终浓度的100mM氯化钾、终浓度2.5mM的乙二胺四乙酸、质量百分终浓度1%的NP40，所述多重荧光PCR反应母液按体积比：多重10×PCR反应缓冲液 2.5ul，浓度20mg/ml牛血清白蛋白0.5ul，引物O1Pf、O1Pr、O139Pf、O139Pr、toxRPf、toxRPr各0.2ul，引物tdhPf、tdhPr各0.3ul，探针O1Pb、O139Pb、toxRPb、tdhPb各0.4ul，无RNA酶DEPC水18.3ul组成，所述多重10×PCR反应缓冲液含有终浓度100mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸，终浓度500mM的氯化钾，质量百分终浓度50%的甘油，终浓度各为0.2mM 的dATP、dGTP、dTTP和dGTP，终浓度2mM的氯化镁，引物O1Pf的核苷酸序列为CCAGATTGTA AAGCAGGATG GA，引物O1Pr的核苷酸序列为GGTCATCTGT AAGTACAAC，探针O1Pb的核苷酸序列为FAM-CCCGGAGTTT GTAAGCCCAC TACCGGG-DABCYL，引物O139Pf的核苷酸序列为CATACCAACG CCCTTATCCA TT，引物O139Pr的核苷酸序列为GCATGACTGG CATCCCAAAA T，探针O139Pb的核苷酸序列为CY5-CGGGTGAGAA AAGACAGCAA TAACACCCG-DABCYL，引物toxRPf的核苷酸序列为AAGCGCCAGT AGTACCTGA，引物toxRPr的核苷酸序列为CCAATCTGAC GGAACTGAGA TT，探针toxRPb的核苷酸序列为ROX-CGGCAAATCG GTAGTAATAG TGCCG-DABCYL，引物tdhPf的核苷酸序列为AAACATCTGC TTTTGAGCTT CCA，引物tdhPr的核苷酸序列为CTCGAACAAC AAACAATATC TCATCAG，探针tdhPb的核苷酸序列为HEX-CCGGGGTGTC CCTTTTCCTG CCCCCGG-DABCYL。 【当前权利人】宁波检验检疫科学技术研究院 【当前专利权人地址】浙江省宁波市海曙区马园路9号 【引证次数】4.0 【他引次数】4.0 【家族引证次数】4.0 【家族被引证次数】2

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