【摘要】 -官网 本发明涉及一种快速鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物的试纸条及其制备方法，含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A，检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原中的一种或两种印制，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体溶液印制。本发明的试纸条特异性强，灵敏度高，简便，直观，准确，适用范围广，成本低，专业和非专业人士均可随时随地实时检测，易于推广应用。 【专利类型】发明授权 【申请人】河南省农业科学院 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】450002 河南省郑州市金水区花园路116号 【申请人地区】中国 【申请人城市】郑州市 【申请人区县】金水区 【申请号】CN201210281588.3 【申请日】2012-08-09 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102818898B 【公开公告日】2014-10-29 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102818898B 【授权公告日】2014-10-29 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】G01N33/68; G01N33/569; G01N33/558 【发明人】张改平; 杨苏珍; 卢清侠; 职爱民; 杨继飞; 乔松林; 邓瑞广 【主权项内容】1.一种一步鉴别口蹄疫病毒感染和疫苗免疫动物试纸条的制备方法，其特征是：所述试纸条含有支撑层和吸附层，吸附层附着在支撑层上，吸附层从测试端依次为样品吸附纤维层、金标抗体纤维层、纤维素膜层和手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有检测印迹和对照印迹，其特征是：所述金标抗体纤维层上吸附有胶体金标记的葡萄球菌蛋白A即SPA，所述检测印迹用大肠杆菌表达系统表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原，对照印迹用羊或兔抗SPA的IgG抗体印制；其制备方法方法包括以下步骤：(1)大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原的制备；(2)胶体金标记的葡萄球菌蛋白A的制备：以柠檬酸钠还原法制备胶体金，进而获得胶体金标记的SPA；(3)羊抗或兔抗SPA的IgG抗体的制备：用所得的大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原和非结构蛋白3ABC抗原分别在纤维素膜层上制成检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG抗体在纤维素膜层上制成对照印迹；将胶体金标记的葡萄球菌蛋白A用于制备金标抗体纤维层，然后将支撑层、吸附层和保护层依次组装成试纸条；其中大肠杆菌表达并纯化的猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原的制备方法如下：根据O 型FMDV VP1模板基因序列设计一对特异性引物：上游引物5’ATAGGATCCATGACCACTGCTACCGGGGAGTC3’ 引入酶切位点BamHI，下游引物5’ATAAAGCTTCAAGAGCTGCTTTGCGGGTG3’引入酶切位点HindIII；以重组质粒pMD18T-VP1 为模板，进行PCR 扩增，获得VP1 基因；PCR 产物经BamHI 和HindIII 双酶切消化克隆到PET-28a 载体中，转化大肠杆菌，将重组菌在LB培养基中培养至OD600 达到0.6 时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导剂，使其浓度为0.5mmol/L，在37℃诱导表达6小时，将表达菌液离心，收获细菌沉淀；将得到的菌体重悬于20毫升缓冲液中，超声破碎后离心收集沉淀，用洗液洗涤包涵体5次，将沉淀悬于20毫升悬浮液中洗涤1次，最后离心沉淀得到纯化后的包涵体；将纯化后的包涵体溶于pH为 8.0的变性剂中，于4℃搅拌10小时，离心去除不溶物，得到变性蛋白；取90毫升变性蛋白装入透析袋，并将透析袋放入1.8升复性缓冲液中，4℃条件下搅拌透析，每5小时换液一次，换液4次后用1.8升 PBS透析4次，前两次透析12小时/次，后两次透析6小时/次；收集透析袋内的液体，经10000转/分钟、4℃ 离心10分钟，弃去沉淀，将上清用0.45微米滤膜过滤；用20KD 的浓缩管浓缩，3000转/分钟、4℃离心30分钟，收集浓缩蛋白，于-20℃冷冻保存。 【当前权利人】河南省农业科学院 【当前专利权人地址】河南省郑州市金水区花园路116号 【统一社会信用代码】12410000415803948G 【被引证次数】2 【被他引次数】2.0 【家族引证次数】4.0 【家族被引证次数】15

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