【摘要】 本发明公开了一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法，在家蚕微孢子感染的家蚕体腔注射脂质体包裹的转基因载体，2～4天后取蚕血淋巴加入家蚕BmN培养细胞中培养；当微孢子虫呈绿色荧光时，用昆虫培养基极度稀释，加入到细胞培养板中，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔，添加正常培养细胞培养2～4天，获得感染培养细胞；重复至少3次，取获得的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子，感染家蚕，家蚕发病后，从感染组织纯化获得转基因家蚕微孢子。运用本发明的技术方案可以将外源基因整合进家蚕微孢子虫基因组，实现了用基因工程技术改造家蚕微孢子虫，实现调节微孢子虫基因的表达水平，为微孢子虫基因功能研究提供了方法。 【专利类型】发明授权 【申请人】苏州大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】215123 江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路199号 【申请人地区】中国 【申请人城市】苏州市 【申请号】CN201210242668.8 【申请日】2012-07-13 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102787073B 【公开公告日】2014-05-14 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102787073B 【授权公告日】2014-05-14 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N1/11; C12N15/63; C12R1/90 【发明人】贡成良; 曹广力; 薛仁宇; 朱越雄; 郭睿; 郑小坚; 潘中华 【主权项内容】1.一种构建转基因家蚕微孢子虫的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 用家蚕微孢子感染家蚕，感染后3～4天，体腔注射脂质体包裹的含有绿色荧光蛋白基因表达盒的转基因载体，继续饲养；所述转基因载体为非转座子转基因载体pIZT/V5-His或piggyBac转座子转基因载体pigA3GFP； (2) 2～4天后取家蚕的蚕血淋巴，用荧光显微镜进行观察，若观察到有部分血细胞呈绿色荧光，则取该家蚕的蚕血淋巴加入家蚕BmN培养细胞中，25～27℃培养；若没有观察到绿色荧光，则重复步骤(1)和(2)； (3) 每隔2～3天，吸出一半旧培养液，补加新鲜培养基和正常家蚕BmN培养细胞，25～27℃培养； (4) 每天采用荧光显微镜观察培养细胞，当发现感染培养BmN细胞内的微孢子虫呈现绿色荧光时，取出部分感染培养细胞，提取总DNA, 用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，当扩增出荧光蛋白基因的特异性条带时，取未使用的部分感染培养细胞，进行步骤(5)，否则重复步骤(4)； (5) 取部分感染培养细胞，用昆虫培养基极度稀释，加入到细胞培养板中，荧光显微镜观察，选择仅有一个培养细胞呈现绿色荧光的培养孔，添加新鲜正常培养细胞，25～27℃培养2～4天，获得感染培养细胞； (6) 重复步骤(5)至少2次，每次采用上一次获得的感染培养细胞作为本次的初始感染培养细胞； (7) 取经过上述处理的感染培养细胞，匀浆破碎细胞，差速离心，纯化微孢子；取部分微孢子虫提取微孢子虫DNA，用荧光蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，如果扩增出荧光蛋白基因的特异性条带，则用获得的微孢子虫感染家蚕，家蚕发病后，从感染组织纯化获得转基因家蚕微孢子。 【当前权利人】苏州大学 【当前专利权人地址】江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路199号 【统一社会信用代码】123200004660073435 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】3

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