【摘要】 本发明涉及从胎盘中分离间充质干细胞的方法。所述方法包括(a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液；(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％CO2培养箱中培养；(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。通过本发明方法可以获得高纯度的胎盘间充质干细胞。 【专利类型】发明授权 【申请人】博雅干细胞科技有限公司 【申请人类型】企业 【申请人地址】214092 江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201210044648.X 【申请日】2012-02-27 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102676451B 【公开公告日】2014-04-16 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102676451B 【授权公告日】2014-04-16 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N5/0775; C12N5/0735; G06F19/28 【发明人】霍思维; 陈俊峯; 张毅; 许晓椿; 李诣书 【主权项内容】1.从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤： (a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液； (b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育10~20分钟消化； (c)将组织块用铜网过滤，研磨以促使过滤； (d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5%CO2培养箱中培养； (e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞； (f)针对步骤(e)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、HLA-ABC/DR配型； (g)将步骤(e)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存； (h)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(g)的冻存细胞进行关联， 其中，在步骤(b)中，所述PBS缓冲液中包含0.1 mg/mL dispase、0.25 mg/mL胰酶、0.25 mg/mL DNase I、1 mg/mL胶原酶IV和1 mg/mL透明质酸酶。 2．根据权利要求1的方法，其中所述步骤(a)是在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用含10%体积胎牛血清的PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘小叶中残留的血液。 3．根据权利要求1的方法，其中在步骤(b)中，在37℃孵育10分钟。 4．根据权利要求1的方法，在步骤(b)中，在37℃孵育20分钟。 5．根据权利要求1的方法，在步骤(d)中，所述MSC培养基是含10%FBS的PBS缓冲液。 6．根据权利要求1的方法，在步骤(e)中，待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞60～90%融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞。 7．根据权利要求1的方法，在步骤(h)中，所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、胎儿及其父母的详细资料。 8．根据权利要求1至7任一项的方法，其中所获得的胎盘间充质干细胞的细胞纯度大于95%。 9．根据权利要求1的方法，该方法包括以下步骤： 产后四小时之内在无菌条件下将胎盘小叶剪下，用含10%体积FBS的PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶去除胎盘小叶中残留的血液； 先将胎盘小叶剪成1cm3大小的组织块，加入到含有0.1 mg/mL dispase、 0.25 mg/mL 胰酶、 0.25 mg/mL DNase I、 1 mg/mL 胶原酶IV、 1 mg/mL 透明质酸酶的PBS缓冲液中37℃消化15分钟，加入适量FBS终止消化； 再将组织块和细胞悬液一起用200目铜网过滤同时用注射器活塞研磨组织块，收集过滤后的细胞悬液加入到离心管中1000rpm离心10分钟，倒掉上清，用含10%FBS的PBS缓冲液重悬细胞； 然后用密度梯度离心法分离收集单个核细胞，PBS缓冲液洗涤单个核细胞后用MSC培养基悬浮所获得的细胞，接种单个核细胞的密度为细胞培养瓶内表面积每75cm2 1×107单个核细胞共10ml MSC培养基； 最后将培养瓶放到37℃ 5%CO2培养箱中培养，72小时后全量换液去除非贴壁细胞，培养瓶中会有散在的梭型贴壁细胞，加入新鲜MSC培养液继续培养； 10天时，散在贴壁细胞形成克隆后，用0.05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，细胞计数后，按照3000细胞/cm2 进行传代培养； 之后，当细胞达到70%融合时消化传代培养，即得胎盘间充质干细胞； 针对所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、HLA-ABC/DR配型； 将所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存； 建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联。 【当前权利人】博雅干细胞科技有限公司 【当前专利权人地址】江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号 【专利权人类型】有限责任公司 【统一社会信用代码】91320211553793530T 【引证次数】5.0 【被引证次数】30 【他引次数】5.0 【被自引次数】25.0 【被他引次数】5.0 【家族引证次数】9.0 【家族被引证次数】50

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