【摘要】 本发明建立了一种合成百草枯抗原的方法和应用多克隆抗体检测百草枯的直接竞争ELISA试剂盒的构建方法。试剂盒的组成包括：百草枯酶标物、百草枯标准液、包被百草枯多克隆抗体的酶标板、底物显色液、洗涤液、终止液、酶标物稀释液及样品稀释液等。本发明建立了人工合成百草枯抗原的方法，以BSA为载体制备多克隆抗体；应用多克隆抗体制备的ELISA试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强和价格低廉等诸多优点，适合工厂化生产，可对大豆等农产品中百草枯进行快速检测。 【专利类型】发明授权 【申请人】江南大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201210081393.4 【申请日】2012-03-26 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102633876B 【公开公告日】2014-10-22 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102633876B 【授权公告日】2014-10-22 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C07K14/765; C07K16/06; G01N33/543 【发明人】孙秀兰; 尤继明; 李红梅; 郑佳玉; 张弓; 纪剑; 田秀梅; 张银志 【主权项内容】一种合成百草枯抗原的方法，其特征在于，以百草枯为半抗原，以4, 4’-联吡啶和碘甲烷为起始原料，首先合成N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶二溴化物，用于制备百草枯的人工抗原；具体方法如下：1)4, 4’-联吡啶和碘甲烷以摩尔比1.05 : 1在无水丙酮中反应，4℃，磁力搅拌，于密闭三颈圆底烧瓶通氮气保护下在暗处反应；反应混合物完全加入后，低温搅拌过夜；过滤，用无水丙酮洗涤，抽干，得产品N-甲基-二吡啶阳离子化合物，真空干燥，得黄色针状结晶，然后存放于真空干燥器中；将得到的N-甲基-二吡啶阳离子化合物和5-溴戊酸乙酯以摩尔比1 : 2混合，120℃油浴，磁力搅拌，在新鲜蒸馏的无水二甲基甲酰胺中回流5h，然后室温放置过夜；抽滤，用无水DMF洗涤，真空干燥，得黄色片状结晶N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶阳离子化合物，存放于真空干燥器中；将得到的N-甲基-N′-戊酸乙酯基-二吡啶阳离子化合物与适量浓HCl混合，加热回流3h；在旋转蒸发器上蒸去过量的酸和水，保持水浴温度不超过60℃，蒸干，得固体残留物；冷却后，加入少量丙酮结晶，过滤，抽干，真空干燥，得粗品，再经95％乙醇重结晶，真空干燥，得到高纯度N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物；2)43mgBSA溶于3ml水中，用0.1M的NaOH调pH至9.0；9mgN-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物溶于500μl二噁烷中，进行超声处理；加入无水三正丁胺15μl，将此混合物在12℃冰浴中冷却，并搅拌15min；加入重蒸的氯甲酸异丁酯8μl，15℃以下搅拌30min；将搅拌后的N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物溶液逐滴加入到溶解的BSA蛋白中，并于4℃轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9.0；将混合物于4℃在0.1M的PBS中透析72h，每隔6h换透析液一次，冷冻干燥后于-20℃保存，获得PQ-h-BSA免疫抗原；3)28mgOVA溶于3ml水中，用0.1M的NaOH调pH至9.0；9mgN-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物溶于500μl二噁烷中，进行超声处理；加入无水三正丁胺15μl，将此混合物在12℃冰浴中冷却，并搅拌15min；加入重蒸的氯甲酸异丁酯8μl，15℃以下搅拌30min；将搅拌后的N-甲基-N′-戊酸基-二吡啶阳离子化合物溶液逐滴加入到溶解的OVA中，并于4℃轻微搅拌4h，整个过程维持pH在9.0；将混合物于4℃在0.1M的PBS中透析72h，每隔6h换透析液一次，冷冻干燥后于-20℃保存，获得PQ-h-OVA免疫抗原。 【当前权利人】上海雄图生物科技有限公司 【当前专利权人地址】上海市松江区广富林路697弄21号1324-1室 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】1210000071780177X1 【被引证次数】2 【被他引次数】2.0 【家族被引证次数】6

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