【摘要】 本发明的绵羊FGF5基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，确定绵羊Noggin基因编码区的全序列；将目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表达载体中，获得FGF5和FGF5S基因慢病毒载体，生产重组病毒，感染293T细胞，验证重组蛋白的表达；其中扩增外显子1的引物；扩增5-RACE引物；扩增外显子3的引物；扩增3-RACE的引物；以外显子3测序结果设计3-RACE引物：其中以5-RACE和3-RACE测序结果设计扩增FGF5全长的引物：扩增FGF5的全长cDNA序列，测序确定FGF5和FGF5S的全长序列；克隆与测序：将绵羊FGF5基因的扩增产物进行回收纯化后，利用T4DNA连接酶将其与连接PMD-18T载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。 【专利类型】发明申请 【申请人】新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国 澳大利亚绵羊育种研究中心 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市沙依巴克区克拉玛依东街151号 【申请人地区】中国 【申请人城市】乌鲁木齐市 【申请人区县】沙依巴克区 【申请号】CN201010580043.3 【申请日】2010-12-09 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102181448A 【公开公告日】2011-09-14 【公开公告年份】2011 【授权公告号】CN102181448B 【授权公告日】2013-02-27 【授权公告年份】2013.0 【IPC分类号】C12N15/12; C12N15/10; C12N15/867 【发明人】刘明军; 贺三刚; 李文蓉; 张雪梅; 张宁 【主权项内容】1.绵羊FGF5基因的克隆和慢病毒表达载体的构建，其特征在于：1)确定绵羊Noggin基因编码区的全序列；2)将目的基因定向克隆于pLEX慢病毒表达载体中，获得FGF5和FGF5S基因慢病毒载体，生产重组病毒，感染293T细胞，验证重组蛋白的表达；其中扩增外显子1的引物：上游引物TTCCCCGAGGCTATGTCCAC，下游引物ATCCATTGACTTTGCCATCCG；其中扩增5-RACE引物：以外显子1测序结果设计5-RACE引物：上游引物(CLONTECH，SMART RACE cDNA Amplofication Kit，试剂盒自带)，下游引物GSP1：CTGCTCTGCTCCAAGCCGCTTC，NGSP1：GAAGAAGAGGAAGACACGGTGCT；其中扩增外显子3的引物：上游引物CAGATGACTGCAAGTTCAGG，下游引物CAAAGCGAAACTTGAGTCTGT；其中扩增3-RACE的引物，以外显子3测序结果设计3-RACE引物：上游引物(CLONTECH，SMART RACE cDNA Amplofication Kit，试剂盒自带)GSP2：CAAGCAATCGGAGCAGCCAGAAC，NGSP2：GAAGTCCTAACACGGTGAAATAC；其中以5-RACE和3-RACE测序结果设计扩增FGF5全长的引物：上游引物ATAGCGGCCGCGGAAGCATGAGCTTGTCCTT，下游引物GGCCTCGAGTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAACCAAAGCGAAACTTGAGT；扩增FGF5的全长cDNA序列，测序确定FGF5和FGF5S的全长序列；3)克隆与测序：将绵羊FGF5基因的扩增产物进行回收纯化后，利用T4 DNA连接酶将其与连接PMD-18T载体，转化E.coli DH5α；利用氨苄青霉素平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆测序由上海生物工程公司完成。 ： 【当前权利人】新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国 澳大利亚绵羊育种研究中心 【当前专利权人地址】新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市沙依巴克区克拉玛依东街151号 【引证次数】1.0 【被引证次数】5 【他引次数】1.0 【被自引次数】2.0 【被他引次数】3.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】5

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