【摘要】 。本发明公开了一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法及其应用。田间烟粉虱的采集、预处理及研磨后，利用番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，建立检测传毒介体烟粉虱的dot-ELISA方法，并研发快速检测试剂盒，对田间烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的情况进行检测。利用该发明可对田间烟粉虱的带毒率进行大规模调查，预测田间番茄黄化曲叶病的流行爆发趋势。该检测方法快速高效、灵敏特异、高通量又操作简便，为番茄黄化曲叶病毒病的快速诊断、预测预报及科学防控提供技术支撑。 【专利类型】发明授权 【申请人】浙江大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号 【申请人地区】中国 【申请人城市】杭州市 【申请人区县】西湖区 【申请号】CN201210423231.4 【申请日】2012-10-30 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102937652B 【公开公告日】2014-07-23 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102937652B 【授权公告日】2014-07-23 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】G01N33/577 【发明人】谢艳; 周雪平; 吴建祥; 矫晓阳; 刘欢 【主权项内容】1.一种快速检测烟粉虱携带番茄黄化曲叶病毒的dot-ELISA方法，其特征在于包括如下步骤：1)田间烟粉虱的采集、预处理及研磨；2)硝酸纤维素(NC)膜准备：用铅笔在NC膜外层纸上划线，使NC膜印上方格线痕迹，每格规格1×1 cm，平整放入培养皿中央；3)点样：吸取研磨的烟粉虱研磨液2 μL，点样于NC膜的格子中央；4)封闭：点样后，将NC膜静置晾干10分钟，使用按5 g脱脂奶粉加100 mL PBST缓冲液的比例配制得到5%的脱脂奶粉封闭，37℃静置0.5-1小时；所述的PBST缓冲液为含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS；5)加一抗：加入中国专利申请号为201210004197.7的番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体用5%的脱脂奶粉1 : 2000倍稀释, 37℃孵育1小时；6)洗涤：弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5次，每次3分钟；7)加酶标二抗：弃洗脱液，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脱脂奶粉1 : 1000倍稀释，37℃孵育1小时；8)洗涤：弃液体，NC膜用PBST缓冲液摇动洗脱5~6次，每次5分钟；9)显色：弃洗脱液，将NC膜用滤纸吸干或静置晾干，加入TMB显色液显色，避光静置5~10分钟；10)终止反应：待NC膜上的样品呈现蓝色而阴性对照未显色时弃显色液终止反应；11)记录结果：ddH2 O浸泡NC膜，晾干后记录结果；所述的田间烟粉虱的采集、预处理及研磨包括如下步骤：1)烟粉虱采集：从大田中用吸虫器采集捕获烟粉虱；2)烟粉虱存放：95%的酒精中室温存放；3)烟粉虱预处理：移液枪吸掉95%的酒精，ddH2O清洗3遍，去掉酒精；4)烟粉虱研磨：用毛笔蘸取单头烟粉虱，置于干净的封口膜上，室温晾干5分钟；晾干后，每头烟粉虱滴加2 μL 0.05 mol/L PBS缓冲液，用0.5 mL离心管底磨碎至肉眼不能看到明显组织。 【当前权利人】浙江大学 【当前专利权人地址】浙江省杭州市西湖区浙大路38号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12100000470095016Q 【引证次数】5.0 【自引次数】2.0 【他引次数】3.0 【家族引证次数】6.0 【家族被引证次数】9

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