【摘要】 本发明公开了重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，特点是包括将人工合成的人源LECT2基因插入胞外表达载体pPICZαA中构建重组表达质粒的步骤；酶切线性化后电击导入毕赤酵母X33中，获得重组工程菌株的步骤；经过摇瓶发酵和甲醇诱导，实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达的步骤；再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白的步骤，优点是首次提出了重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中得分泌表达和纯化制备方法，采用毕赤酵母大量表达高活性的重组人源LECT2蛋白，具有稳定、产量高、活性强等优势，可用于制药和诊断检测。 【专利类型】发明授权 【申请人】宁波大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】315211 浙江省宁波市江北区风华路818号 【申请人地区】中国 【申请人城市】宁波市 【申请人区县】江北区 【申请号】CN201210018774.8 【申请日】2012-01-20 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102559739B 【公开公告日】2014-06-25 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102559739B 【授权公告日】2014-06-25 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N15/81; C12N15/19; C12N1/19; C07K14/52; C07K1/18; C07K1/16; C12R1/84 【发明人】陈炯; 史雨红; 章瑞程; 陆新江; 李长红; 李明云 【主权项内容】1.一种重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤如下：(1)构建重组表达质粒抽取人外周血细胞中RNA，逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登录号为NM002302，以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白，将含人源LECT2基因的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切，将酶切后的PCR产物与用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切的质粒pPICZαA用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α中，得到重组表达质粒pPICZα-LECT2；(2)筛选高表达重组工程菌株将重组表达质粒pPICZα-LECT2经SacI酶切后，将感受态毕赤酵母X33细胞与经SacI酶切线性化的重组表达质粒pPICZα-LECT2按比例16μl : 1μg混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子经博莱霉素Zeocin高抗性筛选及PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/pPICZα-LECT2；将获得的博莱霉素高抗性重组工程菌株X33/pPICZα-LECT2接种于BMGY培养基中，培养至OD600达2.0～6.0收集细胞，重悬于BMMY培养基中，0.5%甲醇诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60-70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株，具体过程如下：a.电击转化感受态毕赤酵母X33获得转化子将80μL感受态毕赤酵母X33细胞和5μg SacI酶切线性化的重组表达质粒混合，在1500V，25μF，200W条件下电击转化，用浓度为1mol/L山梨醇悬浮，30℃静置1小时，再加入YPD培养基，振荡培养3小时得到转化液，将转化液涂布含100μg/ml博莱霉素Zeocin的YPDS平板，30℃培养3～4天，得到大量转化子；b.博莱霉素高抗性重组工程菌株X33/pPICZα-LECT2的制备将转化子点到含1000μg/ml博莱霉素的YPDS培养基上，获得博莱霉素高抗性菌株，将博莱霉素高抗性菌株的菌落置于无菌水中，混匀并煮沸，离心后取上清进行PCR扩增，阳性克隆获得博莱霉素高抗性重组工程菌株X33/pPICZα-LECT2；c.高表达重组工程菌株的制备将博莱霉素高抗性重组工程菌株X33/pPICZα-LECT2接种于5mL BMGY培养基中，30℃培养22-26小时至OD600达2.0～6.0，1500rpm离心5min收集菌体，用40mL BMMY培养液悬浮菌体，0.5%甲醇诱导表达，30℃继续培养70-75小时，每24小时补加一次甲醇，取发酵液离心，上清液用于12%SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot蛋白免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60-70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株；(3)高表达酵母菌株扩大培养将高表达重组工程菌株接种于100mL BMGY培养基生长，30℃培养22-26小时直至OD600达2.0～6.0，1500rpm离心5min收集菌体，然后将菌体转入400mLBMMY培养基中进行甲醇诱导，0.5%甲醇诱导表达，30℃继续培养70-75小时，每24小时补加一次甲醇，使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白；(4)重组人源LECT2蛋白的纯化收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后，再经superdex75分子筛分离纯化，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白，具体如下：收集步骤(3)扩大发酵后得到的上清液浓缩至10mL后，上样强阳离子交换柱，以3.0ml/min的流速洗脱，洗脱液为1mol/L氯化钠溶液，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩至500μl后，上样superdex75分子筛层析柱，以1.0ml/min的流速洗脱，洗脱液为100mmol/L碳酸铵溶液，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。 【当前权利人】宁波大学 【当前专利权人地址】浙江省宁波市江北区风华路818号 【统一社会信用代码】123300004195291066 【家族引证次数】3.0 【家族被引证次数】9

未经允许不得转载：http://www.zhongzhencnc.com/1791357793.html