【摘要】 ： 本发明公开了一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，特点是具体步骤如下：取患病死亡的三疣梭子蟹置于8-10倍体积的高盐TNE2缓冲液中，匀浆直至完全碎裂；将匀浆后的组织悬液分装离心管中，离心收集上清液，将离心所得沉淀再次匀浆离心，收集上清液；合并两次离心所得上清液经8000g，4℃离心20min，取上清液于4℃，35000g离心1.5h，将离心所得的沉淀的上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层白色沉淀部分重悬于TM2缓冲液中；将浸泡后的下层白色沉淀部分重新完全悬浮起来，4℃下3500g离心5min，取上清液于重复上一步步骤，得到的下层结实的纯白色部分即纯化病毒粒子.优点是高效、快速、简便、低成本。 【专利类型】发明授权 【申请人】宁波大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】315211 浙江省宁波市江北区风华路818号 【申请人地区】中国 【申请人城市】宁波市 【申请人区县】江北区 【申请号】CN201210576754.2 【申请日】2012-12-26 【申请年份】2012 【公开公告号】CN103013932B 【公开公告日】2014-11-05 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN103013932B 【授权公告日】2014-11-05 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N7/02 【发明人】李登峰 【主权项内容】1.一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的纯化方法，其特征在于采用多次差速离心的纯化方式纯化病毒，具体步骤如下： (1)取患病死亡的三疣梭子蟹解剖，取内脏与鳃剪碎后，置于预先冰浴过的8-10倍体积的高盐TNE2缓冲液中，匀浆直至完全碎裂； (2)将匀浆后的组织悬液分装于50ml离心管中，4℃6000g离心10min，收集上清液，将离心所得沉淀的用高盐TNE2缓冲液重悬，再次匀浆数分钟，4℃6000g10min离心，收集上清液；将两次离心所得上清液合并；所述的高盐TNE2缓冲液的各组分浓度为：50mM Tris-HCl，400mM NaCl，5mM EDTA，1mM的蛋白酶抑制剂，pH为8.5； (3)将合并后的上清液经8000g，4℃离心20min，取上清液； (4)将步骤(3)得到上清液于4℃，35000g离心1.5h，将离心所得的沉淀的上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层白色部分重悬于1-3ml的TM2缓冲液中，4℃冰浴过夜；所述的TM2缓冲液各组分浓度为：50mM Tris-HCl，10mMMgCl2，260mM NaCl, 1mM的蛋白酶抑制剂，pH为7.5； (5)将浸泡后的下层白色沉淀部分重新完全悬浮起来，4℃下3500g离心5min，弃去沉淀；取上清液于4℃下，38000g离心1.5h；将离心得到的沉淀上层疏松部分用TM2缓冲液小心冲洗掉，下层结实的纯白色部分即纯化的三疣梭子蟹呼肠孤病毒粒子。 【当前权利人】宁波大学 【当前专利权人地址】浙江省宁波市江北区风华路818号宁波大学 【统一社会信用代码】123300004195291066 【引证次数】1.0 【他引次数】1.0 【家族引证次数】4.0 【家族被引证次数】5

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