【摘要】 本发明涉及一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法。其技术要点是：将种子萌发1～2d，芽伸长至0.2～2cm时，去除胚芽鞘暴露生长点；用刷毛单根直径4～20μm、露出长度0.5～3mm、根数100～5000根的微创刷蘸农杆菌介导转化液，对生长点实施刺刷，进行较充分的微创转化；完成共培养后进一步发育成苗，促进穗、粒发育，分株收获；T1代进行鉴定。本发明的优点是不需要组织培养、不受基因型限制、不必须抗性筛选、操作简便、易规模化，适用于所有结种子的单子叶植物。利用本发明涉及的方法，在小麦、水稻、玉米的遗传转化上，分别获得了转化率为49%、66.3%、100%的转化效果。 【专利类型】发明授权 【申请人】河北省农林科学院遗传生理研究所 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】050051 河北省石家庄市和平西路598号 【申请人地区】中国 【申请人城市】石家庄市 【申请人区县】桥西区 【申请号】CN201210300322.9 【申请日】2012-08-22 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102876712B 【公开公告日】2014-01-29 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102876712B 【授权公告日】2014-01-29 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N15/84; A01H5/00 【发明人】王海波; 董福双; 吕孟雨; 张艳敏; 任志恒; 杨帆; 梁新潮; 左文博; 石学萍; 张欢欢; 高义平; 赵和; 徐显; 孙果忠; 柴建芳; 刘永伟; 朱金永; 韩秋芬; 张强; 马辉杰; 王占武; 关军锋 【主权项内容】1.一种充分微创种子芽生长点的单子叶植物转基因方法，其特征在于：(1)受体及侵染液的准备挑选拟转化植物品种的饱满、无破损、无霉变的种子，去掉残留物，有壳的去掉壳，水洗，25℃下浸泡7 ～ 10h，常规消毒，用无菌水洗净，摆放于灭过菌的含2 层滤纸、直径为90mm 的玻璃培养皿中，加无菌水，无菌水的加入量以保持滤纸湿润为宜，28℃暗培养发芽1 ～ 2d ；所述受体为经上述处理过的种子的芽生长点；划板挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接入含50mg/L 卡那霉素、40mg/L 利福平的LB液体培养基，28℃、220 rpm 暗培养至菌液OD600=0.5 ～ 0.6，4000rpm、5min 离心收集菌体，弃上清液加入1/5 ～ 1/2 所述LB 液体培养基体积的侵染基液，摇匀制备成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS 的盐、10g/L 葡萄糖、40g/L 麦芽糖，pH 5.6 ；(2)芽生长点暴露与微创转化①时机把握：对于籽粒较小的植物芽伸长到0.2 ～ 2cm 时，对于籽粒较大的植物芽伸长到0.3 ～ 1cm 时，实施转化处理；所述籽粒较小的植物包括小麦、水稻、谷子、黍子和高粱，所述籽粒较大的植物包括玉米；②暴露生长点的方法对于地中茎不伸长的植物，直接用摄子掰去胚芽鞘和已分化出的幼叶即可；对于地中茎伸长的植物，找出地中茎与生长点结合区形成的折光带，在靠近折光带的上方用刀片切去芽鞘和已分化出的幼叶；③用微创转基因刷转化用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准拟转化种子的芽生长点刺刷2 ～ 3次，然后按种子芽生长点向上的方向摆放于铺有2 层滤纸、灭过菌的培养皿中，所述滤纸用无菌水润湿，每个培养皿中放置10 ～ 40 粒种子；(3)共培养往放有转化处理过的芽生长点种子的培养皿中滴加无菌水使培养皿中的滤纸保持湿润，无菌水的滴加量为0.5 ～ 3ml，盖上皿盖，置于25℃暗培养3d ；(4)苗培养将完成共培养的材料，用蛭石覆盖根系，或转至含蛭石的钵器，25℃、光照12h/d 培养直至成苗；对于不需做春化处理的作物，培养7d 就移栽于温室，或完成共培养后就直接移播于温室，覆罩上塑料薄膜，7 ～ 10d 后揭膜；对于需春花处理的冬小麦，则先25℃、光照12 h/d 培养7d，然后转到8℃的春化箱内春化处理20 ～ 30d，具体天数因品种而定；(5)幼苗移栽苗长成后，移栽于按要求隔离防护的温室或农田；(6)苗及植株管理采取水肥措施促进苗健壮发育，促进多结粒；对于雌雄异花的玉米及时做好雌雄穗的套袋防护和人工授粉工作；(7)分子检测与鉴定在T0 代不进行检测，以免结果不真实；将T0 植株所结的种子，按单株收获；将所收种子逐株萌发成苗进行检测，即在T1 代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR 检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行PCR 检测；对经PCR 鉴定为阳性的材料，进行Southern blot 检测予以确证；所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛单根直径为4 ～ 20μm，每刷的刷毛根数为100 ～ 5000 根，刷毛露出长度为0.5 ～ 3mm。 【当前权利人】河北省农林科学院遗传生理研究所 【当前专利权人地址】河北省石家庄市和平西路598号 【引证次数】2.0 【他引次数】2.0 【家族引证次数】7.0 【家族被引证次数】21

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