【摘要】 本发明涉及一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法。其技术要点是：去掉一片子叶暴露生长点，用可移栽的营养基质体育苗；用刷毛单根直径4～20μm、露出长度0.5～3mm、根数100～5000根的微创刷蘸农杆菌介导转化液，对所述生长点刺刷，实施非离体转化；完成共培养后进一步发育成苗，带营养基质体移栽，促铃、荚、果及籽粒发育，分株收获；T1代进行鉴定。本发明的优点是不需要离体培养、不需要嫁接、不受基因型限制、不必须抗性筛选、移栽成活率高且缓苗快、操作简便、易规模化，适用于所有结种子的双子叶植物。利用本发明在棉花、大豆的转化中，分别获得了转化率为50%和76.5%的转化效果。。 【专利类型】发明授权 【申请人】河北省农林科学院遗传生理研究所 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】050051 河北省石家庄市和平西路598号 【申请人地区】中国 【申请人城市】石家庄市 【申请人区县】桥西区 【申请号】CN201210300379.9 【申请日】2012-08-22 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102864165B 【公开公告日】2014-01-29 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102864165B 【授权公告日】2014-01-29 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N15/82; A01H5/00 【发明人】王海波; 吕孟雨; 董福双; 张艳敏; 任志恒; 杨帆; 孙果忠; 徐显; 石学萍; 张欢欢; 赵和; 柴建芳; 高义平; 刘永伟; 朱金永; 韩秋芬; 张强; 马辉杰; 王占武; 关军锋 【主权项内容】1.一种充分微创种子芽或幼苗茎的生长点的双子叶植物转基因方法，其特征在于：(1)前期准备在培养皿中加2层滤纸，高温消毒备用；用纸卷成直径2～5cm的纸筒，做成纸桶，加满蛭石，制成微型柱状可连同苗一起移栽的“营养基质体”，将其纵向排放于塑料盒内备用；(2)受体及侵染液的准备选取拟转化植物的饱满、无破损、无病斑、无霉变的种子，常规消毒，用无菌水洗3～5遍；对于子叶皱摺不容易分开的植物，将种子播于所述营养基质体，播深0.5～1.0cm，沿盒壁浇水使水渗透至纸桶顶部的蛭石，盖上盒盖，培养3d；对于子叶易分开的植物，将种子置于消过毒的含2层滤纸的培养皿中，加刚好使种子吸胀水量的无菌水，培养2～3d至根长达0.4cm以上；所述受体为经上述处理过的种子芽或幼苗茎的生长点；培养条件：25℃、暗培养；所述子叶皱摺不易分开的植物包括棉花；所述子叶易分开的植物包括大豆、绿豆和黄瓜；挑取带有外源基因的农杆菌单菌落，接种到含50mg/L卡那霉素、40mg/L利福平的LB液体培养基，28℃、220 rpm暗培养至菌液OD600=0.5～0.6，4000rpm、5min离心收集菌体，弃上清液，加入1/5～1/4所述LB液体培养基体积的侵染基液摇匀，制成所述侵染液，即农杆菌介导转化液；所述侵染基液含100μmol/L AS、100mg/L F68、400mg/L MES、1/10 MS盐、30g/L葡萄糖、68g/L蔗糖，pH 5.6；(3)生长点暴露与用微创转基因刷转化去掉一片子叶暴露种子芽或幼苗茎的生长点，用微创转基因刷蘸所述农杆菌介导转化液后，对准欲转化的种子芽或幼苗茎的生长点刺刷2～3次；(4)共培养对于子叶皱摺不容易分开的植物，转化处理后，将装有所述营养基质体的塑料盒盖盖上培养；对于子叶易分开的植物，转化后按去子叶面向上的方向放于加有2层滤纸的培养皿，所述滤纸用无菌水润湿，盖上培养皿盖培养；共培养条件：25℃、暗培养3d；(5)成苗培养及移栽完成共培养后，对于已在所述营养基质体上生长的植物，将塑料盒盖揭开进行光照培养，培养至长出1片真叶展开；对于子叶易分开的植物，光照培养1d后，按根朝下的方向插到所述营养基质体上，培养至1片真叶展开；培养条件：25℃，光照12h /d；成苗后连同所述营养基质体一起移栽于按转基因管理标准隔离的温室或农田；(6)苗及植株管理采取光温水肥措施，促进苗健壮发育，促进植株多长果枝、多结桃或荚或果、多结籽粒；(7)检测在T0代不进行检测，以免结果不真实；将T0代植株所结的种子，按单株收获；将所收种子萌发成苗进行检测，即在T1代开始检测、鉴定；对于外源基因有抗性功能的，先进行抗性筛选，然后对选出的抗性苗或植株进行PCR检测；对于不具有抗性功能的，直接逐株进行PCR检测；对经PCR鉴定为阳性的材料，进行Southern blot检测予以确证；所述微创转基因刷，其刷毛由微米级的不锈钢纤维或碳硅纤维或玻璃纤维制成，刷毛纤维直径为4～20μm，每刷的刷毛根数为100～5000根，刷毛露出长度0.5～3mm。 【当前权利人】河北省农林科学院遗传生理研究所 【当前专利权人地址】河北省石家庄市和平西路598号 【引证次数】3.0 【自引次数】1.0 【他引次数】2.0 【家族引证次数】5.0 【家族被引证次数】9

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