【摘要】 本发明涉及玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus)Men-myco-93-63的nsdBmgh基因、制备方法及其应用。本发明以天蓝色链霉菌A3(2)抗生素代谢途径中重要的负调控基因nsdB的序列自主设计引物Ns8F和Ns8R，扩增玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因组DNA，得到了1121bp的片段；随后利用非特异引物锚定PCR(NPA-PCR)方法对该靶序列两端进行延伸，获得玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的nsdBmgh基因。通过基因中断对该基因进行了功能验证，基因阻断突变株比出发菌株代谢产物的抑菌活性明显提高。nsdBmgh基因的制备和应用为进一步研究和探明玫瑰黄链霉菌抗生素合成代谢途径和调控机理提供了又一重要依据，为防治植物病害的抗生素高产基因工程菌株的应用奠定了重要的基础。 【专利类型】发明授权 【申请人】河北农业大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】071001 河北省保定市灵雨寺街289号 【申请人地区】中国 【申请人城市】保定市 【申请人区县】莲池区 【申请号】CN201210083746.4 【申请日】2012-03-27 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102634523B 【公开公告日】2014-04-16 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102634523B 【授权公告日】2014-04-16 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N15/31; C07K14/36; C12N15/63; C12N1/21; C12N15/76; A01N47/44; A01P3/00; C12N15/10; C12R1/465 【发明人】李亚宁; 刘大群; 孟庆芳; 张立荣; 李星; 张娜; 冀红柳; 张汀 【主权项内容】1.一种玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的 nsdBmgh基因片段在制备生防菌玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因突变株中的应用，其特征在于包括下述步骤： (1)根据国际基因库GenBank上编号为SCO7252的天蓝色链霉菌nsdB基因的序列设计一对特异引物Ns8F和Ns8R，扩增玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63基因组DNA，结果得到长度为1121bp的片段；所述Ns8F的序列为：GTGGATCGACATGGGAGAGAT，Ns8R的序列为：CCATGGACAGGTAGTCGAAGAT； (2)将得到的1121 bp 的片段连接到 pMD19-T 载体上，构建 pMDNA1121 质粒，再用 HindIII 和 XbaI 双酶切 pMDNA1121，其中包含了部分的 nsdBmgh 基因，将该片段回收后克隆到pKC1139 的 HindIII 和 XbaI 位点上，得到用于 nsdBmgh 基因单交换的重组质粒pSRNA 1121； (3)通过转化将 pSRNA1121 转入 E.coli ET12567(pUZ8002)获得接合转移供体 E. coli ET12567(pUZ8002/ pSRNA1121)； (4)然后通过接合转移转化到玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 的孢子中；在含有安普霉素的 MS 平板上总共得到大约60个转化子，随机挑选其中5 个 转化子转接至含有安普霉素的 SGGP 中富集菌体，提质粒酶切后，证明这 5 个转化子都是正确的；将其中一个转化子转接至含有安普霉素的基本培养基上，28℃ 培养 10d 后，制备孢子悬液；经适当稀释后，以每个平皿 104 个孢子的浓度涂布在含有安普霉素的 PDA 培养基平板上，于 40℃ 高温培养；由于pKC1139 具有温度敏感型复制子，所以在高于 34℃ 条件下不能正常复制；因此，只有 pSRNA1121 上的部分nsdBmgh基因序列与玫瑰黄链霉菌 Men-myco-93-63 染色体发生了同源重组-单交换的菌株才能在含有安普霉素的基本培养基上生长；结果在 40℃ 高温培养长出转化子，即获得玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63基因突变株。 【当前权利人】河北农业大学 【当前专利权人地址】河北省保定市莲池区灵雨寺街289号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12130000401707023F 【引证次数】1.0 【自引次数】1.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】9

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