【摘要】 本发明涉及生物化学与分子生物学领域。具体而言，特指一种从人体细胞众多E3中查找出特异性识别靶蛋白泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化反应的E2/E3系统的方法。该方法是先建立体外泛素化分析系统，通过已知的泛素活化酶E1和以HelaS100馏分作为E3源，筛选出介导靶蛋白泛素反应的结合酶E2；再采用多重层析柱组合，结合质谱分析，从人体细胞中查找特异性识别靶蛋白的泛素连接酶E3和调控靶蛋白泛素化修饰的E2/E3系统。通过这种方法，可以方便、准确地查找出识别靶蛋白的底物识别因子－泛素连接酶E3；建立介导靶蛋白泛素化修饰的E2/E3调控系统。 【专利类型】发明授权 【申请人】江苏大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】212013 江苏省镇江市学府路301号 【申请人地区】中国 【申请人城市】镇江市 【申请人区县】京口区 【申请号】CN201210401583.X 【申请日】2012-10-19 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102936618B 【公开公告日】2014-04-09 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102936618B 【授权公告日】2014-04-09 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12Q1/25; G01N33/68 【发明人】张倩; 周亚竟; 陈慧卿; 陈克平; 麦维军; 刘晓勇; 何远清; 李国辉; 张磊; 刘留; 樊晓婷; 宋惠芳 【主权项内容】1.基于已知泛素活化酶E1查找特异性介导靶蛋白泛素反应结合酶E2和连接酶E3的方法，包括以下步骤：(1)建立泛素化修饰反应的体外分析系统和结合酶E2的确定：泛素反应的体外分析系统是以经纯化的GST融合靶蛋白作为基质，GST为对照，还包括：泛素，一种已知的泛素活化酶E1，结合酶E2，未知的连接酶E3，Ubiquitin aldehyde，ATP能量再生系统；结合酶E2的确定过程是将以上反应混合物于反应缓冲液中300C下反应60分钟；反应完成后，用Glutathione珠回收GST融合蛋白或GST的耦合物，SDS-PAGE电泳并转膜后，以抗泛素的抗体Western Blot检测靶蛋白-泛素耦合物，从待选的多种结合酶E2中筛选出在已知泛素活化酶E1情况下介导靶蛋白多泛素化反应最强的、与未知连接酶E3配对的结合酶E2；(2)对特异性识别靶蛋白的连接酶E3进行查找：人体细胞抽提液经过免疫亲和层析柱、Phenyl Sepharose疏水层析柱、Mono Q离子交换层析柱和Superdex 200分子筛层析柱4个不同性质的层析柱，每一步层析后，运用上述所建立的泛素反应体外分析系统，对各洗脱馏分检测连接酶E3的活性，合并含连接酶E3活性的洗脱馏分峰，再通过下一个层析柱，在最后一步层析后，对含连接酶E3活性馏分峰进行质谱鉴定，确定出特异性识别靶蛋白的连接酶E3。 【当前权利人】江苏大学 【当前专利权人地址】江苏省镇江市学府路301号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】123200004660115453 【引证次数】2.0 【自引次数】2.0 【家族引证次数】3.0 【家族被引证次数】6

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