【摘要】 本发明公开了一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法，包括下列步骤：(1)通过基因工程方法制备带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6；(2)采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹；(3)收集接种病毒4～6天后的五龄家蚕幼虫或蛹，采用冷冻干燥法制备获得冻干粉；(4)将步骤(3)获得的冻干粉与粉状鱼饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为1～10%。本发明可以直接作为口服疫苗使用，具有制备工艺简单、成本低、方便使用，具有蛋白亚单位疫苗和核酸疫苗双重功能等优点。 【专利类型】发明授权 【申请人】苏州大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】215123 江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路199号 【申请人地区】中国 【申请人城市】苏州市 【申请号】CN201210116061.5 【申请日】2012-04-19 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102614509B 【公开公告日】2014-08-20 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102614509B 【授权公告日】2014-08-20 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】A61K39/15; A61P31/14; C12N15/46; C12N7/01; C12N15/866 【发明人】贡成良; 薛仁宇; 曹广力; 陈辉; 刘林; 徐诗英; 邹勇 【主权项内容】1.一种草鱼出血病口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括下列步骤： (1) 通过基因工程方法制备带有草鱼出血病病毒结构蛋白VP6基因的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6； (2) 将重组杆状病毒BmNPV-IIVP6感染家蚕培养细胞BmN进行扩增，采用扩增后的重组杆状病毒BmNPV-IIVP6接种至五龄家蚕幼虫或蛹； (3) 收集接种病毒4～6天后的五龄家蚕幼虫或蛹，采用冷冻干燥法制备获得冻干粉； (4)将步骤(3)获得的冻干粉与粉状鱼饲料均匀混合，即获得草鱼出血病口服疫苗，按重量计所述冻干粉在草鱼出血病口服疫苗中的含量为1～10%； 所述步骤(1)具体包括以下步骤： ①根据GenBank已公开的草鱼出血病病毒结构蛋白VP6的cDNA编码序列，合成5’端和3’端分别带EcoRI和HindⅢ位点的VP6基因的编码序列，克隆进T-载体，获pMD19T-VP6质粒； ②用EcoRI/HindⅢ双酶切消化pMD19T-VP6质粒，回收VP6基因片段，用EcoRI/HindⅢ双酶切消化供体质粒pFastBac-Dual，回收pFastBac-Dual片段，将VP6基因片段插入到pFastBac-Dual的EcoRI和HindⅢ之间，将VP6基因克隆进pFastBac-Dual载体中的杆状病毒多角体基因启动子下游获得pFastBac-ph-VP6重组质粒； ③以pMD19T-VP6质粒为模板，PCR合成5’端和3’端分别带XhoI和KpnI位点的VP6基因的编码序列，XhoI/KpnI 双酶切后克隆进用XhoI/KpnI双酶切的 pFastBac-ph-VP6中获 pFastBac-VP6-ph-VP6； ④根据GenBank已公开的团头鲂Megalobrama amblycephala的 β-肌动蛋白启动子序列合成5’端和3’端分别带SmaI和XhoI位点的β-肌动蛋白启动子序列，克隆进T-载体，获pMD19T-β-actin质粒； ⑤用SmaI/XhoI双酶切pMD19T-β-actin质粒，回收β-肌动蛋白启动子序列片段，SmaI/XhoI双酶切pFastBac-VP6-ph-VP6，将β-肌动蛋白启动子序列片段插入到pFastBac-VP6-ph-VP6的SmaI和XhoI之间，获得pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒； ⑥将pFastBac-FA-VP6-ph-VP6重组质粒转化大肠杆菌BmDH10Bac感受态细胞，涂布于含四环素、卡那霉素、庆大霉素、IPTG和X-gal的LB 琼脂培养平板上，37℃培养1～2天，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid 基因组Bacmid-IIVP6 DNA； ⑦将Bacmid-IIVP6 DNA由脂质体介导转染家蚕培养细胞BmN，培养细胞后取上清，获得重组杆状病毒BmNPV-IIVP6； 所述步骤(3)中冻干粉的制作方法是，取收集的五龄家蚕幼虫或蛹，冰浴匀浆，加入3～5倍重量的生理盐水，混匀，过滤，滤液冷冻干燥至水份含量小于2wt%，粉碎过筛，获得冻干粉。 【当前权利人】苏州大学 【当前专利权人地址】江苏省苏州市苏州工业园区仁爱路199号 【统一社会信用代码】123200004660073435 【引证次数】2.0 【自引次数】2.0 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】6

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