【摘要】 本发明一种可溶藻的赖氨酸芽孢杆菌原生质体制备与再生方法，属于环境工程微生物领域。本发明采用原生质体制备与再生方法，工艺简单，便于操作，可重复性强；所获得的原生质体制备率最高可达86.25%，且再生率最高可达在76.81%，原生质体体制备率高且原生质体活性保持较好，有利于后续兼具溶藻与降解MC-LR功能的融合子的制备与再生。 【专利类型】发明授权 【申请人】常州大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】213164 江苏省常州市武进区滆湖路1号 【申请人地区】中国 【申请人城市】常州市 【申请人区县】武进区 【申请号】CN201210342222.2 【申请日】2012-09-17 【申请年份】2012 【公开公告号】CN103013849B 【公开公告日】2014-07-23 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN103013849B 【授权公告日】2014-07-23 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N1/20; C12R1/01 【发明人】张文艺; 陈雪珍; 李仁霞; 李秋艳 【主权项内容】1.一种溶解铜绿微囊藻的赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)的原生质体制备与再生方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)菌种活化培养：将保藏的菌株F8重新转接至平板划线分离3次，挑取单菌落接种至新鲜的细菌液体培养基中，置于温度为30℃，转速120 r/min的振荡培养箱中纯培养至对数期，为108-109个/ml；(2)原生质体的破壁酶解：取4 ml活化的菌液，4500 r/min离心10 min，收集菌体，经SMM缓冲液洗涤3次，用3.2-3.8ml的SMM缓冲液重悬；加入0.1-1 mg/mL的溶菌酶0.2-0.8ml，在水浴温度30℃条件下酶解0.17-1 h；酶解结束后，3000 r/min离心收集原生质体，用0.55 mol/L的NaCl溶液洗涤3次，洗去酶解液后用4 ml 0.55 mol/L NaCl溶液悬浮即可制备得到原生质体；(3)原生质体的再生：取上述步骤的原生质体悬浮液，用高渗NaCl溶液稀释到合适的三个梯度，分别吸取200 μl涂布于高渗固体培养基，每个梯度做三个平行，置于30℃恒温培养箱培养48 h，使得原生质体再生；步骤(1)中菌种活化培养用细菌培养基组成如下：牛肉膏3 g；蛋白胨10 g；NaCl 5 g；蒸馏水1000 mL；pH 7.0-7.2；若为固体培养基则添加琼脂粉2.4%；上述培养基根据要求在高压灭菌锅中于121℃条件下灭菌20 min；所述F8菌株保藏号为CGMCC NO.6106。 【当前权利人】安徽黄河水处理科技股份有限公司 【当前专利权人地址】江苏省常州市武进区滆湖中路21号 【统一社会信用代码】12320000466007300P 【引证次数】4.0 【自引次数】2.0 【他引次数】2.0 【家族引证次数】4.0 【家族被引证次数】4

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