【摘要】 本发明属于免疫检测及生物技术领域，具体涉及一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原的制备方法及应用。利用丁基硼酸封闭脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的7, 15-羟基，戊二酸酐酰化3-羟基合成3-HG-DON，通过二环已基碳二亚胺活泼酯法将3-HG-DON偶联到载体蛋白BSA，得到人工抗原DON-HG-BSA。本发明提供的制备方法尽量避免反应副产物的生成，降低或避免蛋白对半抗原的掩蔽效应，制备过程温度条件比较温和，在10~37℃之间，避免高温条件下DON氧化而产生副产物，操作简易可行。 【专利类型】发明申请 【申请人】江苏省农业科学院 【申请人类型】科研单位 【申请人地址】210014 江苏省南京市玄武区钟灵街50号 【申请人地区】中国 【申请人城市】南京市 【申请人区县】玄武区 【申请号】CN201010602291.3 【申请日】2010-12-23 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102120766A 【公开公告日】2011-07-13 【公开公告年份】2011 【IPC分类号】C07K14/76; G01N33/53 【发明人】张旭; 邢锦城; 马鸿翔; 余桂红; 孙晓波 【主权项内容】1.一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇人工抗原DON-HG-BSA的制备方法，其特征是由以下步骤构成：(1)(A)采用丁基硼酸(BBA)封闭脱氧雪腐镰刀菌烯醇C7和C15上的羟基，形成环状内酯DON-BBA；(B)用戊二酸酐同C3上的羟基发生酰化反应，形成BBA-DON-HG，并用甲醇解封闭，形成3-HG-DON；(C)用DCC方法将3-HG-DON与BSA载体蛋白偶联，得到人工抗原DON-HG-BSA；(2)步骤(A)中将脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶解于无水四氢呋喃后与丁基硼酸(BBA)混合，脱氧雪腐镰刀菌烯醇与丁基硼酸的物质的量比为：1：8~10；脱氧雪腐镰刀菌烯醇与无水四氢呋喃的体积比为：0.01~ 0.02(g/mL)；室温振荡反应12-16小时，以薄层色谱(TLC)检测监控反应程度，直至DON封闭完全，形成DON-BBA；(3)步骤(B)中将DON-BBA与4-二甲氨基吡啶(DMAP)(溶于无水四氢呋喃)和戊二酸酐(HG)(溶于无水四氢呋喃)混合，DON-BBA与DMAP和HG的物质的量比为：1：2~4：6~9，4-二甲氨基吡啶与无水四氢呋喃的体积比为1：0.1~0.2(g/mL)，戊二酸酐与与无水四氢呋喃的体积比为1：0.1~0.2(g/mL)；37℃振荡反应2小时后加入蒸馏水400~500μl终止反应，抽真空除去四氢呋喃；氯仿萃取3~4次，合并氯仿相，抽真空去除氯仿，将残留物溶于700~ 800μl甲醇，室温振荡反应(解封闭)12~16小时；薄层层析纯化3-HG-DON(展层剂为氯仿：丙酮：异丙醇=8 : 1 : 1)，紫外光下剖取Rf值小于DON的条带，甲醇洗脱收集，真空干燥得3-HG-DON；(4)步骤(C)中3-HG-DON与N-羟基琥珀酰亚胺NHS及二环已基碳二亚胺DCC混合，溶于无水四氢呋喃中，3-HG-DON与NHS及DCC的物质的量比为：1：0.001~0.003：0.002-0.004；10-14℃振荡反应8~10小时，以薄层色谱TLC检测监控反应程度；真空抽干四氢呋喃，加入200~300μl DMSO溶解，缓慢加入至1200~1300μl牛血清白蛋白溶液，15℃低速(100~120r/min)振荡反应8~10小时，用0.01mol/L pH7.4 PBS缓冲液透析3天，冷冻真空干燥，得到人工抗原DON-HG-BSA，分装4℃保存；(5)溶解载体蛋白的缓冲液为碳酸氢钠水溶液，缓冲液的浓度为0.1~0.2 mol/L，载体蛋白的质量与缓冲溶液的体积比为5~8′10-3(g/mL)。 【当前权利人】江苏省农业科学院 【当前专利权人地址】江苏省南京市玄武区钟灵街50号 【统一社会信用代码】123200004660052848 【被引证次数】2 【被自引次数】1.0 【被他引次数】1.0 【家族被引证次数】2

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