【摘要】 。本发明公开了一种肌肉生成抑制素基因敲除猪的制备方法。属于生物技术领域。在293Ft细胞中生产能表达靶向猪肌肉生成抑制素(myostatin)基因的shRNA的病毒颗粒，然后用生产出的这种慢病毒感染猪胎儿成纤维细胞，48小时后通过荧光定量PCR检测发现有效地抑制了细胞中Myostatin基因的表达。本发明慢病毒颗粒可以用于显微注射猪受精卵卵周隙，使病毒核酸整合到胚胎基因组并表达shRNA，经胚胎移植后可以生产Myostatin敲除转基因猪。该慢病毒颗粒还可以用于精子载体法制作转基因猪。可避开传统的同源打靶基因敲除的繁琐操作，病毒消耗少而且可稳定传代。 【专利类型】发明申请 【申请人】南京农业大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】210095 江苏省南京市卫岗1号南京农业大学科技处 【申请人地区】中国 【申请人城市】南京市 【申请人区县】玄武区 【申请号】CN201010272528.6 【申请日】2010-09-06 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102021201A 【公开公告日】2011-04-20 【公开公告年份】2011 【发明人】刘红林; 邹晓龙; 姜保春 【主权项内容】一种肌肉生成抑制素基因敲除猪的制备方法，其特征是，①从人血基因组中经PCR扩增得到的U6启动子序列连入pBluescript ⅡKS(+)质粒，得到pBluescript‑U6载体；②设计靶向猪Myostatin的siRNA序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，加上一个Loop序列SEQID NO.3转换成shRNA序列并交给公司合成，得到的shRNA经退火后连接到pBluescript‑U6载体的U6启动子下游，得到能表达shRNA的质粒；③将步骤②中构建的表达shRNA的质粒用Pst I和Xho I进行双酶切，酶切产物经浓度为1.5％琼脂糖胶电泳分离后切胶回收429bp的U6‑shRNA片段；④先以pLenti6/V5‑GW/LacZ慢病毒系统的表达质粒为模板，设计引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，用高保真酶进行PCR扩增，得到的产物为6558bp的慢病毒载体骨架片段，将该产物胶回收并用Pst I和Xho I进行双酶切，酶切产物经浓度1.0％琼脂糖凝胶电泳分离后再次切胶回收；⑤将U6‑shRNA片段和慢病毒载体骨架片段按3∶1摩尔比混合，在T4连接酶作用下16℃连接过夜，然后转化至JM109感受态细胞中，37℃培养过夜，次日挑选单克隆菌落，构建的质粒命名为pLenti‑U6‑shRNA；⑥将重组慢病毒表达质粒pLenti‑U6‑shRNA与ViraPowerTM Packaging Mix按1∶3质量比例混合，质粒混合物再与脂质体按1μg∶3μl的比例混合孵育制作DNA‑脂质体转染复合物，共转染293Ft细胞生产病毒；将生产的病毒进行超速离心浓缩，病毒沉淀用PBS重悬；⑦病毒悬液用于猪受精卵卵周隙注射，每枚注射滴度为1×109IU/ml的病毒液100pl，注射后的受精卵在体外培养72小时，然后移植到代孕母猪子宫制备转基因猪；或将病毒悬液通过与猪精子共孵育后人工受精制备转基因猪。 【当前权利人】南京农业大学 【当前专利权人地址】江苏省南京市卫岗1号南京农业大学科技处 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12100000466007562R 【被引证次数】TRUE 【家族被引证次数】TRUE

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