【摘要】 本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7蛋白的表达和ELISA抗体的检测方法，属于高新生物技术领域。以纯化的PRRSV重组NSP7蛋白作为包被抗原，通过一系列反应条件优化，建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。该抗原与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪伪狂犬(PRV)和猪2型圆环病毒阳性血清反应呈阴性，该方法特异性良好，具有较好的特异性和重复性。应用本方法对30份血清样品进行检测，检测结果与IDEXX和韩国JENO公司的VDPro试剂盒符合率分别为为93.3％和90％。表明本实验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性，适于大规模检测PRRSV血清抗体的流行病学调查。 【专利类型】发明申请 【申请人】南京农业大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】210095 江苏省南京市卫岗1号 【申请人地区】中国 【申请人城市】南京市 【申请人区县】玄武区 【申请号】CN201010278518.3 【申请日】2010-09-10 【申请年份】2010 【公开公告号】CN101948515A 【公开公告日】2011-01-19 【公开公告年份】2011 【IPC分类号】C07K14/08; C12N15/40; C12N15/63; G01N33/569; G01N33/543 【发明人】刘婷婷; 李玉峰; 姜平 【主权项内容】猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP7重组蛋白，是通过以下方法表达获得的：1.1NSP7基因的扩增、克隆和鉴定设计两对引物，上游引物P1：CATGGATCCTCGCTGACTGGTGCC，下游引物P2：TAGCGGCCGCTTATTCCCACTGAGCTCTTCTA；分别引入Not I和BamH I酶切位点，以PRRSV的cDNA产物为模板进行PCR扩增，获得NSP7蛋白目的基因条带，将扩增的目的条带克隆至pET‑28a载体，获得重组质粒pET‑28a‑NSP7；1.2NSP7蛋白的表达和纯化将重组质粒pET‑28a‑NSP7转化入大肠杆菌BL21中，涂布氨苄青霉素抗性培养皿，37℃过夜培养；挑取单个菌落接种3毫升LB培养基，37℃过夜振荡培养；第二天取1％的过夜培养物接种新鲜LB培养基，当细菌浓度OD600达到0.4～0.6时，加入终浓度1.5mmol/L IPTG，诱导4h诱导表达基因工程重组菌500ml，离心收集菌体，诱导后的细菌按每100mL菌液加入5mL PBS重悬菌体沉淀，经超声裂解后，按按照Invitrogen公司Ni‑NTA试剂盒说明书进行亲和层析纯化，收获NSP7重组蛋白。 【当前权利人】南京农业大学 【当前专利权人地址】江苏省南京市卫岗1号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12100000466007562R 【引证次数】1.0 【被引证次数】13 【他引次数】1.0 【被他引次数】13.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】13

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