【摘要】 本发明公开了高效表达山羊生长激素GH的乳腺特异性表达载体，属于生物工程技术领域。GH的cDNA序列见SEQ ID NO.1。生长激素既可以促进乳腺导管形成，也可以促进山羊的乳腺上皮细胞的增殖，从而增加产奶量。将本发明构建的乳腺特异性表达载体pcGH采用脂质体法，导入体外培养的人乳腺癌细胞Bcap-37中，在转染后收集细胞培养上清；采用ELISA的方法检测细胞培养上清中的GH含量。结果显示与未转染pcGH的空白组细胞相比，转染pcGH组细胞GH表达量显著提高。表明pcGH载体可已在乳腺细胞上成功表达GH，为下一步生产转gh基因奶山羊奠定坚实的基础。 【专利类型】发明申请 【申请人】南京农业大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】210095 江苏省南京市卫岗1号 【申请人地区】中国 【申请人城市】南京市 【申请人区县】玄武区 【申请号】CN201010544629.4 【申请日】2010-11-16 【申请年份】2010 【公开公告号】CN101985635A 【公开公告日】2011-03-16 【公开公告年份】2011 【授权公告号】CN101985635B 【授权公告日】2012-06-13 【授权公告年份】2012.0 【IPC分类号】C12N15/85; C12N15/18; C12N15/12; C12N15/64 【发明人】杨倩; 张强; 庾庆华; 林建 【主权项内容】一种高效表达山羊生长激素GH的乳腺特异性表达载体，其gh基因具有如SEQ ID NO.1所示的序列，其构建方法包括：1)萨能奶山羊生长激素gh的克隆参照Genbank登陆号：Y00767山羊生长激素gh基因的cDNA序列设计一对扩增生长激素cDNA的引物，并在上游引物上引入EcoRI限制性酶切位点，下游引物上引入SalI限制性酶切位点：上游引物ZP3：5’‑TAGAATTCATGATGGCTGCAGGCCCCCGGA‑3’下游引物ZP4：5’‑TAGTCGACCTAGAAGGCACAGCTGGCCTCCCCG‑3’以萨能奶山羊肝脏组织的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后进行PCR扩增；PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，65℃30sec，72℃40sec，30个循环，72℃10min，4℃10min；将PCR产物连接到pMD19‑T载体上，送交上海生工测序。测序后获得具有完整编码区的萨能奶山羊生长激素gh基因的cDNA序列SEQ ID NO.1；2)萨能奶山羊β‑乳球蛋白5端和3端的克隆参照已发表的山羊的β‑乳球蛋白序列Genbank登陆号：Z33881，设计一对扩增β‑乳球蛋白5端的引物，并在上游引物上引入Xho I限制性酶切位点，在下游引物上引入EcoRI限制性酶切位点，引物序列如下：上游引物ZP1：5’‑ATACTCGAGCCAGGCCAGAGGTGCTTTATTTCCG‑3’下游引物ZP2：5’‑TATGAATTCCTTCTGGATGTCCAGGCCTTTCATG‑3’设计一对扩增β‑乳球蛋白3端的引物，并在上游和下游引物上分别引入SalI限制性酶切位点，引物序列如下：上游引物ZP5：5’‑TATGTCGACCCTGCCGGTGCCTCTGTGGTAAGCT‑3’下游引物ZP6：5’‑ATCGTCGACGGGAGTCCTGAAGCGGGAGGGTGTT‑3’以萨能奶山羊肝脏组织提取的DNA为模板，用合成的ZP1、ZP2引物PCR扩增β‑乳球蛋白5端，PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃30sec，61℃30sec，72℃150sec，30个循环，72℃10min，4℃10min；将PCR产物连接到pMD19‑T载体上，测序后获得具有萨能奶山羊β‑乳球蛋白5端的DNA序列SEQ ID NO.2；用合成的ZP5、ZP6引物扩增β‑乳球蛋白3端，PCR反应体系为25uL，PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃30sec，67℃30sec，72℃40sec，30个循环；72℃10min，4℃10min，将PCR产物连接到pMD19‑T载体上，测序后获得具有萨能奶山羊β‑乳球蛋白3端的DNA序列SEQ ID NO.3；3)乳腺特异性表达载体的构建将SEQID NO.1序列、SEQ ID NO.2和序列SEQ ID NO.3序列克隆至骨架载体pIRES2‑EGFP上，获得乳腺特异性表达载体pcGH。 【当前权利人】南京农业大学 【当前专利权人地址】江苏省南京市卫岗1号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12100000466007562R 【引证次数】2.0 【他引次数】2.0 【家族引证次数】2.0

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