【摘要】 本发明公开了一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，首先合成能有效干扰小鼠mCD14基因表达的小干扰核糖核酸分子(siRNA-224.3)及阴性对照siRNA-NC，并制备成重组慢病毒；其次，将慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，并用嘌呤霉素筛选出阳性克隆，构建稳定细胞系siRNA-224.3、siRNA-NC；最后，应用酶联免疫吸附实验检测分别用平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖刺激条件下表达该小干扰核糖核酸分子的小鼠单核巨噬细胞稳定细胞系细胞上清中的一氧化氮、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6，通过比较其差异，实现鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖。本发明的方法相比现有技术更加方便，准确性更高。 【专利类型】发明授权 【申请人】海南大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】570228 海南省海口市人民大道58号 【申请人地区】中国 【申请人城市】海口市 【申请号】CN201210185198.6 【申请日】2012-06-05 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102778570B 【公开公告日】2014-11-05 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102778570B 【授权公告日】2014-11-05 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】G01N33/68; G01N33/53 【发明人】杜丽; 王凤阳; 焦寒伟; 雷明 【主权项内容】1.一种鉴别平滑型脂多糖和粗糙型脂多糖的方法，其特征在于，该方法按照以下步骤具体实施： 步骤1、根据膜结合型白细胞分化抗原14基因的序列，按照小干扰核糖核酸分子设计的基本原则，合成一对针对膜结合型白细胞分化抗原14的小干扰核糖核酸分子siRNA-224.3； 所述的小干扰核糖核酸分子siRNA-224.3的基因序列是： gggcaguuca cugauauuat t； 步骤2、将合成好的siRNA-224.3包装慢病毒载体 2.1)制备寡核苷酸：在Lentivirus-shRNA模板中的loop结构选用TTCAAGAGA；在正义链模板的5’端添加T，与Hpa I酶切后形成的粘端互补；在反义链模板的5’端添加AGCT，与Xho I酶切后形成的粘端互补；T4连接酶连接而成重组载体； 2.2)对Lentivirus-shRNA模板退火，参照表1配置退火体系： 表1 Lentivirus-shRNA模板的退火体系 组分体积(ul)10倍T4 DNA连接酶缓冲液5正义链(100uM)5反义链(100uM)5水35总体积50 退火条件是：93-95℃时为5-6min；83-85℃时为5-6min；73-75℃时为5-6min；68-70℃时为5-6min；4℃-5℃的环境中保存；将得到的退火产物稀释50-52倍至终浓度为200-220nM，用于连接反应； 2.3)构建Lentivirus-shRNA载体，参照表2配置连接体系： 表2 Lentivirus-shRNA载体的连接体系 组分体积(ul)10倍T4 DNA连接酶缓冲液2XhoI+Hpa I酶切后的慢病毒载体1模板(100nM)1T4 DNA连接酶(5 weissU/ul)1水15总体积20 在22℃环境中静置1h后，转化DH5α； 2.4)转染重组质粒以及制备病毒液 293T细胞常规培养于10％的FBS+DMEM，37℃，5％的CO2环境条件中；在转染前一天按3×106cell/皿的密度接种293T细胞于10cm细胞培养皿中，使转染时细胞密度能达到90％-95％，每皿加9ml的10％FBS+DMEM，37℃，5％的CO2环境中培养过夜； 2.4.1)转染前2h将6皿细胞进行换液，10％FBS+DMEM，每皿5ml； 2.4.2)取2个无菌的1.5ml的EP管，分别加入500ul的无血清DMEM，并标记为①、②号管； 2.4.3)往①号管中加入穿梭质粒pGLV-U6-EGFP-shRNA-224共40ug，包装质粒，PG–P1-VSVG、PG-P2-REV以及PG-P3-RRE三者共42ug，总计82ug，将两者混匀；往②号管中加入65×6＝390ul的转染试剂RNAi-mate，混匀，室温静止5min； 2.4.4)5min后，将②号管液体缓慢的加入到①号管中，并轻轻的混匀，室温静止20min； 2.4.5)在20min期间，将各皿293T细胞的上清液弃掉，并用预热的PBS洗两遍，用移液器吸头吸去剩余液体，然后每皿细胞加入5ml预热的DMEM培养基； 2.4.6)20min后，将①号管内的混合液平均分到各皿细胞中，然后放入37℃，5％的CO2培养箱中； 2.4.7)转染6h后，将各皿细胞上清液吸掉，加入10ml新鲜的10％FBS+DMEM，然后放入37℃，5％的CO2培养箱，培养72h； 2.4.8)转染72h后，将6个10cm的细胞培养皿细胞上清液共60ml全部吸到两个50ml离心管中，然后进行低速离心，离心转速1800-1850rpm，离心时间3-3.5min； 2.4.9)低速离心后，取上清液经0.45um的过滤器过滤； 2.4.10)过滤后，取15ml病毒液到纯化管内进行高速离心，离心转速8000-8200rpm，离心时间16-18min； 2.4.11)去除底部的废液，将剩余病毒液加入到超滤管内进行第二次高速离心，离心转速8000-8200rpm，离心时间20-22min；离心到上清液到1ml，即病毒纯化液1ml，分装5管，每管200ul，-80℃条件保存； 步骤3、慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞，构建稳定细胞系，具体步骤是： 3.1)感染前一天用完全培养基将0.5×105个细胞/孔铺于24孔板； 3.2)移去细胞培养液，以MOI＝10, 加入稀释后的病毒液0.5ml，在37℃、5％的CO2条件下过夜； 3.3)24h后移去细胞培养液，每孔加入0.5ml的完全培养液，在37℃、5％的CO2条件下过夜； 3.4)RAW264.7细胞感染96h后，加入终浓度为1-1.1ug/ml的嘌呤霉素筛选，24h后换完全培养基，根据细胞状态换液，直至单克隆形成，并在显微镜下挑取各阳性克隆扩增培养； 步骤4、采用实时荧光定量聚合酶链式反应技术检测稳定细胞系信使核糖核酸的表达水平；采用蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步骤是： 4.1)收集细胞用于总RNA提取：吸出培养液，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加1ml的Trizol反复吹打细胞后收集液体， 设计引物采用膜结合型白细胞分化抗原14：上游引物为：5′-AAC TCGCTC AAT CTG TCT TTC AC-3′， 下游引物为：5′-GCT CAT CTG GGC TAG GGT TC-3′； 甘油醛-3-磷酸脱氢酶： 上游引物为：5′-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3′， 下游引物为：5′-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA-3′， 根据核糖核酸提取试剂盒说明书分提取总核糖核酸；使用第一链试剂盒合成互补脱氧核糖核酸；采用ABI-7500系统，使用荧光定量聚合酶链式反应试剂盒，利用比较CT法来测定膜结合型白细胞分化抗原14的表达水平； 电泳完毕后进行蛋白质印迹，其中的 一抗为：兔抗膜结合型白细胞分化抗原14多克隆抗体，1：300倍稀释，兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶单抗，1：1000倍稀释； 二抗为：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G，1：3000倍稀释； 4.2)收集蛋白进行蛋白质印迹检测稳定细胞系蛋白表达水平，具体步骤包括：洗掉培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加入0.25％胰酶-0.02％EDTA消化3min，再加入1ml的完全培养基终止消化，吹打细胞使其从壁上脱落； 在1000-1050rpm条件下离心细胞，弃上清液，磷酸盐缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清液后，加入一定量的IP裂解液，其中含千分之一的蛋白酶抑制剂PMSF在冰上裂解细胞，反复吹打； 在12000-12500rpm条件下离心取上清液； 利用二喹林甲酸蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，将总蛋白等量上样，在12％的分离胶的浓度下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕后进行蛋白质印迹； 步骤5、分别用S-LPS和R-LPS800ng刺激细胞系，收集细胞培养上清液，Elisa检测细胞因子NO、TNF-α和IL-6，具体步骤如下： 5.1)将RAW264.7、siRNA-224.3细胞系和siRNA-NC细胞系用无双抗培养基以2×105个细胞/孔铺于两块12孔板，在37℃、5％的CO2条件过夜； 5.2)在两块12孔板分别加入800ng的S-LPS和800ng的R-LPS，轻轻摇匀后，在37℃、5％的CO2条件下培养6-6.5小时，收集细胞培养上清液； 5.3)根据试剂盒说明书，检测细胞因子一氧化氮、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6， NO LPS组即阴性对照组为：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3；S-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用S-LPS刺激；R-LPS刺激组：RAW264.7、siRNA-NC、siRNA-224.3分别用R-LPS刺激， 分别用S-LPS和R-LPS刺激之后收集上清，通过与对照组的siRNA-NC、RAW264.7进行比较，稳定细胞系siRNA-224的S-LPS处理组上清中分泌的NO、TNF-α和IL-6降低差异极显著，而稳定细胞系siRNA-224的R-LPS处理组上清中分泌的NO、TNF-α和IL-6降低无显著性差异，以此能够明确鉴别出S-LPS和R-LPS两种不同类型的脂多糖，即成。 【当前权利人】海南大学 【当前专利权人地址】海南省海口市人民大道58号 【统一社会信用代码】12460000428200732M 【引证次数】3.0 【他引次数】3.0 【家族引证次数】3.0 【家族被引证次数】1

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