【摘要】 本发明涉及一种简单有效的血液免疫细胞的提取方法，以及相配套使用的冻存和复苏的方法，以及复苏后免疫细胞扩增的方法，其包括如下步骤：全血样本预处理、Ficoll法分离、MNC收集和洗涤、MNC计数、MNC冻存、细胞复苏、MNC计数和细胞扩增。本发明发现使用特定操作步骤的提取、冻存、复苏以及扩增，可以有效地获得免疫细胞，该免疫细胞可用于治疗肿瘤。 【专利类型】发明授权 【申请人】博雅干细胞科技有限公司 【申请人类型】企业 【申请人地址】214092 江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201210379431.4 【申请日】2012-10-09 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102876631B 【公开公告日】2014-04-09 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102876631B 【授权公告日】2014-04-09 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N5/078; C12N5/0784; C12N5/0783; A01N1/02; A61K35/14; A61P35/00 【发明人】姚静; 杨传庆; 张辉; 郑爱玲; 张星星; 朱晓青 【主权项内容】1.从血液中提取免疫细胞的方法，该方法包括以下步骤： (1)全血样本预处理：将血样本充分混匀，转移至离心容器中，稀释血液； (2)Ficoll法分离：取离心容器，加入Ficoll细胞分离液，然后将稀释后的血液样本加入Ficoll细胞分离液的上层，将离心容器置于离心装置中，离心处理； (3)单个核细胞收集和洗涤：离心处理结束后，将上层血浆转移至离心容器，吸取白膜层于离心容器内，补充生理盐水，混匀后再次离心处理，待细胞沉淀后洗涤两次； (4)针对步骤(3)所得免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型； (5)单个核细胞冻存：向步骤(3)提取的免疫细胞中加入冻存液，重悬免疫细胞，将免疫细胞加入冻存容器，程序降温，然后再将冻存容器置于液氮罐中长期储存；其中所述的冻存液是按照20-60重量份的X-VIVO无血清培养基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的。 2．根据权利要求1的方法，其还包括以下步骤： (6)建立包含步骤以上信息的免疫细胞的数据库，并使该数据库与步骤(5)的冻存免疫细胞进行关联。 3．根据权利要求1的方法，其中步骤(2)加入的Ficoll细胞分离液与稀释后血液样本的体积比为1：10-10：1。 4．根据权利要求1的方法，其中步骤(2)加入的Ficoll细胞分离液与稀释后血液样本的体积比为2：7-7：2。 5．根据权利要求1的方法，其中步骤(2)加入的Ficoll细胞分离液与稀释后血液样本的体积比为3：5-5：3。 6．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，X-VIVO无血清培养基的配方量为30重量份。 7．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，X-VIVO无血清培养基的配方量为40重量份。 8．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，X-VIVO无血清培养基的配方量为50重量份。 9．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，人血清白蛋白的配方量为20重量份。 10．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，人血清白蛋白的配方量为30重量份。 11．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，人血清白蛋白的配方量为40重量份。 12．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，DMSO的配方量为8重量份。 13．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，DMSO的配方量为10重量份。 14．根据权利要求1的方法，其中步骤(5)所述的冻存液中，DMSO的配方量为12重量份。 15．根据权利要求2的方法，其还包括以下步骤： (7)细胞复苏：将步骤(5)冻存的冻存容器从液氮罐中取出，水浴，清洗冻存容器表面后转移至生物安全柜中，将免疫细胞转移至装有培养基的离心容器中，重悬，混匀，补加培养基，离心洗涤。 16．根据权利要求15的方法，其还包括以下步骤： (8)针对步骤(7)所得复苏的免疫细胞，检测以下项目的至少一项：单个核细胞总数、单个核细胞活率及复苏率、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型。 17．根据权利要求16的方法，其还包括以下步骤： (9)用含有培养基和血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，吸出细胞培养液，转移至离心容器，反复吹洗贴壁细胞，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，获得未成熟树突状细胞iDC，添加培养基重悬未成熟树突状细胞iDC，将离心容器中的细胞培养液进行离心处理，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞CIK，针对iDC细胞和CIK细胞进行细胞计数，再分别针对iDC细胞及CIK细胞进行培养。 18．根据权利要求17的方法，该方法包括以下步骤： (1)全血样本预处理：上下颠倒血袋4-5次，将血样本充分混匀，血液转移至50ml离心管中，转移至离心容器中的血液按照150ml血量计算，每个离心容器装有25ml血液，共装6管，留取5ml血样于15ml离心管中，进行血型检测，于50ml离心管中加入生理盐水25ml进行等体积1：1稀释，用25ml移液管轻轻充分混匀； (2)Ficoll法分离：按照150ml血量计算，取12支50ml离心管，每管加入Ficoll细胞分离液15ml，用25ml移液管吸取25ml稀释的血样本沿倾斜的管壁缓缓加入于Ficoll细胞分离液上层，Ficoll细胞分离液与血样本比例为3：5，加样过程中避免冲散界面，将加样后的离心管置于水平离心机内离心，水平离心机升速为1，降速为0，转速为2000rpm，离心时间为20min，离心温度为20℃； (3)单个核细胞收集和洗涤：离心结束后，将上层血浆转移至50ml离心管内，轻轻吸取白膜层于50ml离心管内，通常每管25-30ml，补充生理盐水至总体积为45ml，旋紧管盖将离心管上下颠倒混匀4-5次，水平离心，水平离心机升速为9，降速为9，转速为2000rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；第一次洗涤，观察细胞沉淀后，倾去上清液，回流液体，轻轻悬浮细胞沉淀，补充生理盐水至总体积40ml，25ml移液管混匀，旋紧管盖，水平离心，水平离心机升速为9，降速为9，转速为1500rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃；第二次洗涤，观察细胞沉淀后，倾去上清液，回流液体，轻轻悬浮细胞沉淀，补充生理盐水至总体积40ml，25ml移液管混匀，旋紧管盖，水平离心，水平离心机升速为9，降速为9，转速为1200rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃； (4)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数与活率，记录结果； 进一步地，包括以下对提取的免疫细胞进行冻存的步骤： (5)单个核细胞冻存：按照50% X-VIVO无血清培养基+40% 人血白蛋白+10% DMSO的配方配制冻存液15ml，放置4℃冰箱中备用，将上述获得的细胞沉淀按照2×107/ml的密度用冻存液充分混匀重悬，将细胞转移至2ml冻存管中，用封口膜封口并贴上客户标签，将冻存管放入程序降温盒中，放入4℃冰箱储存一个小时，转移至-80℃冰箱储存过夜，次日，从程序降温盒中取出冻存管，转至液氮罐内进行储存，同时程序降温盒放入4℃冰箱以备下一次使用，冻存管在液氮罐中长期储存； (6)记录步骤(5)的冻存样本储存的位置，建立免疫细胞的数据库； 进一步地，包括以下对冻存的免疫细胞进行复苏的步骤： (7)细胞复苏：从液氮罐中取出单个核细胞冻存管，迅速放入预先准备的37℃的水浴锅中，反复振荡8-10次，时间控制在2min以内，直至看到冻存管中只剩下一团冰晶后从水浴锅中取出冻存管，用蘸有75%酒精的无尘布将冻存管表面水滴擦拭后，迅速转移至生物安全柜中，用1ml移液枪将冻存管中复苏后的免疫细胞迅速吸出转移至一装有5ml X-VIVO无血清培养基的15ml离心管中重悬，并用枪头反复吹洗混匀3-5次，补加X-VIVO无血清培养基至10ml，离心洗涤，水平离心机升速为9，降速为9，转速为1800rpm，离心时间为10min，离心温度为20℃； (8)单个核细胞计数：重悬，于细胞沉淀中加入20ml生理盐水，用10ml移液管反复吹吸细胞，充分混匀；细胞计数，吸取20μl细胞，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞总数、活率及复苏率； 进一步地，包括以下对复苏的免疫细胞进行扩增的步骤： (9)细胞扩增：用含有X-VIVO无血清培养基及10%的自体人血清的细胞培养液对复苏后的单个核细胞进行重悬培养，细胞密度为4×106个细胞，置于37℃温度条件下，5%的二氧化碳培养箱中孵育2小时，2小时后，取出细胞培养瓶，将细胞培养液吸出，转移至50ml离心管中，剩下瓶中的贴壁细胞用生理盐水反复吹洗2-3遍，直至贴壁细胞完全不被吹洗下来，此时的细胞为未成熟树突状细胞iDC，添加2-3ml的X-VIVO无血清培养基重悬未成熟树突状细胞iDC，将上述转移至50ml的离心管中的细胞培养液进行离心，获得的细胞沉淀为细胞因子诱导的杀伤细胞CIK，吸取20μl细胞因子诱导的杀伤细胞CIK，加入180μl台盼蓝染液，充分混匀后加入计数板计算细胞因子诱导的杀伤细胞CIK细胞总数和活率，单个核细胞总数减去细胞因子诱导的杀伤细胞CIK总数为未成熟树突状细胞iDC细胞计数，然后分别针对细胞因子诱导的杀伤细胞CIK和未成熟树突状细胞iDC进行细胞培养。 【当前权利人】深圳博雅感知药业有限公司 【当前专利权人地址】广东省深圳市坪山区坑梓街道金辉路14号生物医药创新产业园区10号楼1501室 【专利权人类型】有限责任公司 【统一社会信用代码】91320211553793530T 【被引证次数】15 【被自引次数】2.0 【被他引次数】13.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】30

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