【摘要】 本发明公开了一种无抗生素抗性标记的枯草芽孢杆菌构建方法及筛选靶基因失活的枯草芽孢杆菌的方法。本方法首先以枯草芽孢杆菌168为出发菌株，构建两个同源交换片段，利用同源重组原理，通过两次双交换过程构建了一个可调控的赖氨酸营养缺陷型菌株BS-PS。以大肠杆菌克隆载体pMD19-T为骨架构建了通用型整合突变载体PLC，以枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE为失活靶基因，采用插入失活策略，以PLC为基础，构建了插入失活nprE的整合载体PLC-InprE，转化入BS-PS，通过一次单交换，以及一次自发单交换过程，以控制赖氨酸的合成为筛选标记结合PCR验证结果，对蛋白酶插入失活的突变菌株进行筛选。 【专利类型】发明申请 【申请人】南京农业大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 【申请人地区】中国 【申请人城市】南京市 【申请人区县】玄武区 【申请号】CN201010535809.6 【申请日】2010-11-09 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102021164A 【公开公告日】2011-04-20 【公开公告年份】2011 【授权公告号】CN102021164B 【授权公告日】2013-09-11 【授权公告年份】2013.0 【发明人】陆兆新; 张充; 别小妹; 吕凤霞; 王煜; 赵海珍 【主权项内容】一种无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌构建方法，其特征在于包括下述步骤：(1)分别构建SpovAF‑CM‑Lys和SpovAF‑Pspac‑Lys同源交换片段；(2)利用所述的SpovAF‑CM‑Lys转化枯草芽孢杆菌168感受态细胞，发生一次双交换，该菌株基因组上LysA基因天然启动子被置换为含有终止子的CM基因，得到赖氨酸营养缺陷型突变菌株BS‑CM；(3)利用所述的SpovAF‑Pspac‑Lys转化BS‑CM感受态细胞，发生一次双交换，所述的CM基因被替换为受LacI基因抑制调节的Pspac启动子，得到无抗生素抗性标记的条件赖氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌BS‑PS。 【当前权利人】南京农业大学 【当前专利权人地址】江苏省南京市浦口区泰山街道点将台路40号64号信箱 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12100000466007562R 【被引证次数】TRUE 【家族被引证次数】TRUE

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