【摘要】 本发明公开了一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法。由于本发明采用的引物细菌整合子基因中高度保守的整合酶区域，采用该引物对能准确、快速、方便的判别细菌是否含有整合子，并能区分是I型、II型、III型整合子，建立了一种多重PCR检测I型、II型、III型整合子的方法。通过实验证明该方法具有敏感性高、特异性好的特点，是一种快速准确检测I型、II型、III型整合子的方法。为筛选整合子类型及细菌耐药基因盒的分析，大规模的进行细菌耐药性的分子流行病学调查研究提供一种简便、快捷的方法。 【专利类型】发明申请 【申请人】金陵科技学院 【申请人类型】学校 【申请人地址】210000 江苏省南京市江宁区弘景大道99号 【申请人地区】中国 【申请人城市】南京市 【申请人区县】江宁区 【申请号】CN201010140309.2 【申请日】2010-04-06 【申请年份】2010 【公开公告号】CN101948909A 【公开公告日】2011-01-19 【公开公告年份】2011 【授权公告号】CN101948909B 【授权公告日】2012-09-05 【授权公告年份】2012.0 【发明人】张志成; 丁超艳; 朱佳倚; 方光远; 蒋加进; 张淼 【主权项内容】一种细菌I型、II型、III型整合子基因的PCR检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)PCR模板的制备：(1a)普通肉汤培养基摇瓶培养增菌；(2a)取5mL步骤(1a)得到的菌液，经普通肉汤培养基摇瓶培养3～6h后，置于无菌1.5mL离心管中，8000rpm离心3min，弃上清，再加入1mL无菌超纯水洗涤1～2次，重复离心一次，弃上清，加入500μL无菌超纯水重悬，沸水煮5min，5000rpm离心，取上清备用；(2)PCR扩增：细菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物序列如下：整合酶基因(int I)F：CCTCCCGCACGATGATCR：TCCACGCATCGTCAGGC整合酶基因(intII)F：TCATTAATGCGCAAACCTGCACCAR：ACGCACGGATATGCGACAAAAAGGT整合酶基因(intIII)F：CGGATGTCTGTGCCTGCTTGCR：CCACCGGCAGGCGCTCAAC25μL体系：2×PCRMasterMix 12.5μL；ddH2O 4.5μL；细菌I型、II型、III型整合子基因的上下游引物各1μL；模板2μL；PCR反应条件：94℃3min；然后94℃30s，57℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；(3)琼脂糖凝胶电泳：将0.3g琼脂糖和20mL 50×TAE置于锥形瓶中，完全溶解后加入核酸染料GoldView6.0μL，并倒入已放梳子的槽中，待其凝固后将PCR扩增产物取8μL点于已凝固的琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于TAE中电泳1h；(4)判断结果：紫外投射仪中观察结果，大小约280bp、380bp和650bp的条带，分别指示I型、II型、III型整合子基因。 【当前权利人】迪飞医学科技(南京)有限公司 【当前专利权人地址】江苏省南京市江北新区华康路128号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12320100745357493B 【被引证次数】5 【被他引次数】5.0 【家族被引证次数】6

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