【摘要】 一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法，属于生物技术中病原菌检测技术领域。本发明依次包括以下步骤：(1)污泥样品的梯度稀释及前增菌培养；(2)选择性增菌培养；(3)DNA提取；(4)PCR扩增及扩增产物检测；(5)利用MPN计数软件计算得出结果。本发明采用MPN法和特异性PCR检测相结合的方法，实现了污泥中志贺氏菌的快速定量检测，选择性增菌和特异性PCR能避免其他微生物的干扰，提高检测的灵敏度和特异性。本发明还具有缩短检测时间、提高检测效率和增大检测样品量的优点。 【专利类型】发明申请 【申请人】江南大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学环境与土木工程学院 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201010566883.4 【申请日】2010-12-01 【申请年份】2010 【公开公告号】CN101993954A 【公开公告日】2011-03-30 【公开公告年份】2011 【发明人】刘和; 符波; 王燕; 陈燕 【主权项内容】一种污泥中志贺氏菌的快速定量检测方法，其特征在于检测步骤如下： (1)污泥样品的梯度稀释和前增菌培养：取城市剩余污泥样品混匀，称取3g城市剩余污泥到盛有27mL GN增菌液的50mL的离心管中，涡旋震荡5‑10min，混合均匀得泥水混合物；取0.5mL GN增菌液稀释混匀的泥水混合物加入到经过灭菌的4.5mL GN增菌液中得到各个稀释梯度，设5‑7个稀释度；采用三管或者五管平行法，每个稀释度设3‑5个重复样，于37℃培养18‑24h，直至试管中混合液只呈轻微浑浊停止培养，称之为菌液；(2)选择性增菌培养：移取步骤(1)所得各管中菌液0.5mL加入到志贺氏菌增菌肉汤中，37℃培养18‑24h；(3)DNA提取：移取步骤(2)所得各管中菌液2mL加入到10mL离心管中，10000g离心3 min，弃去上清液；再加入1mL无菌PBS缓冲液，轻轻吹打均匀，10000g离心3 min，弃去上清液；加入10μL超纯水，液氮冷冻和沸水浴反复冻融3次，然后10000g离心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短时间内4℃保存，长时间‑20℃保存；(4)PCR扩增及扩增产物检测：PCR为50μL反应体系：取步骤(3)所得DNA 模板1μL，含MgCl2的10×PCR buffer 5μL，2.5mmol/L的dNTPs 4.0μL，均为20mmol/L的引物P1、P2各0.5μL，5U/μL的rTaq酶0.25μL，加入灭菌双蒸水至50μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，经30个循环；最后72℃延伸10min；延伸后的扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行拍照，产生特异性扩增条带的即为阳性，不产生特异性条带的即为阴性；所述特异性引物为：P1：5’‑CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC‑3’；P2：5’‑CTCATACTTCTGCTCTTCTGCC‑3’；(5)用MPN计数软件计算结果：根据凝胶成像系统拍照结果，确定最大或然数MPN结果，用MPN Calculator软件计算得出污泥中最大可能的志贺氏菌含量。 【当前权利人】江南大学 【当前专利权人地址】江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学环境与土木工程学院 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】1210000071780177X1 【被引证次数】2 【被他引次数】2.0 【家族被引证次数】2

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