【摘要】 本发明是一种涉及限制性内切酶酶切、发卡结构连接和巢式PCR扩增等技术，基于已知DNA序列测定其5′端侧翼未知DNA序列的方法。该方法通过合成一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列；选用单一限制性内切酶酶切基因组DNA，纯化后与发卡结构连接；利用引物设计软件选定发卡结构上的一段特异性序列作为5′端引物、两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以发卡结构连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5′端侧翼的未知序列。本发明具有操作简便、应用范围广、操作限制少、引物特异性强、结果验证简捷、未知序列长度不限和成本低廉等特点。。： 【专利类型】发明申请 【申请人】江南大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201010550905.8 【申请日】2010-11-19 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102140503A 【公开公告日】2011-08-03 【公开公告年份】2011 【IPC分类号】C12Q1/68 【发明人】邬敏辰; 汪俊卿; 张慧敏; 唐存多; 高金湖; 李剑芳; 吴静 【主权项内容】1.一种发卡结构介导的PCR扩增已知DNA序列5′端侧翼未知序列的方法，其特征在于：选用限制性内切酶单酶切基因组DNA；将纯化的酶切产物与发卡结构进行连接；利用引物设计软件选定发卡结构上的一段特异性序列作为5′端引物以及两条靠近未知序列端的已知DNA序列上的互补序列作为3′端引物；以发卡结构连接物为模板，采用设计的引物进行巢式PCR扩增以获取已知DNA序列5′端侧翼的未知序列；(1)引物及发卡结构的设计：依据已知DNA序列设计两条3′端特异性引物，命名为Primer-R1和Primer-R2(18-22bp)；Primer-R2的3′端距待测序列要保留30bp以上长度，它比Primer-R1接近待测定的未知序列；设计一条易形成发卡结构的寡聚核苷酸序列，命名为HSO(41bp)；基于HSO设计一条5′端特异性引物，命名为HSO-F(18bp)；HSO：5′-NNNNCTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAG-3′或 5′-CTACTGGCATGGGCGAGTAATCCGCCCATGCCAGTAGNNNN-3′，HSO-F：5′-ATCCGCCCATGCCAGTAG-3’，其中：NNNN为随机寡聚核苷酸，其位置、序列和长度需要根据步骤(2)选用的限制性内切酶的特性而定；(2)限制性内切酶的选择：分析已知DNA序列上的限制性内切酶位点，选用从Primer-R1到待测的未知序列之间没有酶切位点的内切酶；本发明可供选择常用的产生5′末端突出四个碱基的限制性内切酶有EcoRⅠ、HindⅢ、BglⅡ、SalⅠ、BamHⅠ、NcoⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等；产生3′末端突出四个碱基的有AatⅡ、PstⅠ、SacⅠ和SphⅠ等；产生5′末端突出两个碱基的有ClaⅠ、MspⅠ和NdeⅠ等；(3)发卡结构的形成：对合成的寡聚核苷酸序列HSO进行94℃热变性3min，随后缓慢降温至25℃并保持30min，即可形成发卡结构；(4)PCR模板的构建：采用步骤(2)选择的内切酶对基因组DNA进行单酶切，纯化的酶切产物与步骤(3)形成的发卡结构进行连接，即可作为PCR模板；(5)巢式PCR扩增：以步骤(4)的发卡结构连接物为模板，用HSO-F和Primer-R1为引物进行第一轮PCR扩增；再以首轮PCR扩增产物为模板，用HSO-F和Primer-R2为引物进行第二轮PCR扩增；将两轮PCR(巢式PCR)扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据巢式PCR原理可快速验证其扩增的产物是否为目的片段。 ： 【当前权利人】江南大学 【当前专利权人地址】江苏省无锡市蠡湖大道1800号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】1210000071780177X1 【被引证次数】5 【被自引次数】2.0 【被他引次数】3.0 【家族被引证次数】5

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