【摘要】 一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，它涉及一种质粒载体的构建方法。它解决了目前经代谢工程改造后的酿酒酵母木糖利用率仍然很低，且发酵副产物木糖醇产生量高的问题。构建方法：先克隆KanR基因、XKS1基因、ADH1终止子片段、酿酒酵母中2.2kb rDNA片段；然后回收、纯化基因片段与pGEMT Easy载体连接；再依次构建质粒pR、质粒pRK和质粒pRKT；最后将2.2kb rDNA片段加入质粒pRKT。本发明方法所构建的载体可以将XKS1基因高拷贝整合到酿酒酵母的染色体基因组上，实现XKS1的超量稳定表达，疏通了酿酒酵母利用木糖产乙醇的木糖代谢流，提高了木糖的利用率，降低了副产物木糖醇的产量。 【专利类型】发明申请 【申请人】黑龙江大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】150080黑龙江省哈尔滨市南岗区学府路74号 【申请人地区】中国 【申请人城市】哈尔滨市 【申请人区县】南岗区 【申请号】CN200810064831.X 【申请日】2008-06-30 【申请年份】2008 【公开公告号】CN101302535A 【公开公告日】2008-11-12 【公开公告年份】2008 【授权公告号】CN101302535B 【授权公告日】2010-10-20 【授权公告年份】2010.0 【IPC分类号】C12N15/66; C12N15/54 【发明人】平文祥; 葛菁萍; 凌宏志; 宋刚; 杜春梅; 赵丹; 高冬妮; 曹喜生 【主权项内容】1、一种表达木酮糖激酶基因的质粒的构建方法，其特征在于表达木酮糖 激酶基因的质粒的构建方法按以下步骤进行：一、克隆质粒pKT0150中KanR 基因；二、克隆酿酒酵母XKS1基因；三、克隆质粒pKT0150中ADH1终止 子片段；四、克隆酿酒酵母中2.2kb？rDNA片段；五、回收、纯化步骤一至四 制备的基因片段，然后再分别与pGEMT？Easy载体在16℃的条件下连接 10～12h，得到pGMT-KanR、pGMT-XKS1、pGMT-ADH1T和pGMT-rDNA； 六、构建质粒pR，以酿酒酵母整合载体p406ADH1为骨架引入有抗性标记的 基因KanR；七、构建质粒pRK，将XKS1基因加入质粒pR；八、构建质粒 pRKT，将ADH1终止子片段加入质粒pRK；九、将2.2kb？rDNA片段加入质 粒pRKT，即得到表达木酮糖激酶基因的质粒；其中步骤一中扩增上游引物序 列为5’-TTCCATATGTCTGTTTAGCTTGCCTC-3’，下游引物序列为5’- CTTGACGTCTATCATCGATGAATTCGA-3’；步骤二中扩增上游引物序列为 5’-CGGACTAGTCTCAATCTTCAGCAAGCGAC-3’，下游引物序列为 5’-CGCGTCGACAACGGGGAACAAAATGATG-3’；步骤三中扩增上游引物 序列为5’-CGCGTCGACATTTGTTACTGCTGCTGGTATT-3’，下游引物序列为 5’-CTCGGCCGCCCTGTTATCCCTAGCGG-3’；步骤四中扩增上游引物序列 为5’-TTCCATATGGGAACCTCTAATCATTCGCT-3’，下游引物序列为 5’-TCTCGGCCGAACGAACGAGACCTTAACCT-3’。 【当前权利人】海门市科技发展总公司 【统一社会信用代码】12230000414002858L 【引证次数】2.0 【被引证次数】3 【他引次数】2.0 【被他引次数】3.0 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】3

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