【摘要】 本发明涉及胎盘全细胞分离、冻存和复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤：对胎盘组织进行消毒和清洗；从组织剪下胎盘小叶，消化处理20分钟；配制胎盘组织冻存液备用；将消化处理得到的全细胞和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用；需要时将胎盘全细胞从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗，利用红细胞裂解液清除红细胞，复苏的胎盘全细胞可通过细胞培养和细胞传代扩增间充质干细胞。本发明方法可有效保护冻存胎盘组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。 【专利类型】发明授权 【申请人】博雅干细胞科技有限公司 【申请人类型】企业 【申请人地址】214092 江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201210292509.9 【申请日】2012-08-16 【申请年份】2012 【公开公告号】CN102807966B 【公开公告日】2014-08-13 【公开公告年份】2014 【授权公告号】CN102807966B 【授权公告日】2014-08-13 【授权公告年份】2014.0 【IPC分类号】C12N5/073; C12N5/0735; C12N5/0775; A01N1/02; G06F17/30 【发明人】林卓衡; 朱业峰; 陈俊峯; 周丹 【主权项内容】1.处理胎盘全细胞的方法，该方法包括：(A)以下对胎盘离体新鲜组织全细胞进行分离和冻存的步骤：(1)胎盘组织清洗：通过PBS缓冲液清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；(2)胎盘组织消化处理：从步骤(1)得到的胎盘组织上剪下胎盘小叶，加入PBS缓冲液并将小叶剪碎，加入包含胰酶的消化酶溶液中，消化处理10-30分钟；(3)胎盘组织过滤处理：加入FBS溶液终止消化，将消化处理后的胎盘组织碎片转移至过滤装置，对胎盘组织碎片进行研磨，同时收集滤液，对滤液进行细胞清洗；(4)配制胎盘全细胞冻存液：所述胎盘全细胞冻存液中包含15重量份的人血白蛋白、10重量份的DMSO和65重量份的DMEM-F12，配好的冻存液放在1℃至7℃的温度条件下低温冷藏；(5)胎盘全细胞冻存：将步骤(3)得到的胎盘组织过滤液离心后去除上清液，在1℃至7℃的低温环境下，加入步骤(4)得到的胎盘全细胞冻存液，然后转移至冻存容器中，冻存容器放入程序降温装置，先在1℃至7℃的温度条件下低温冷藏0.2-2小时，再在-80℃的温度条件下冷冻0.25-3天，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；(B)进一步进行以下对冻存的胎盘离体新鲜组织全细胞进行复苏的步骤：(6)冻存胎盘全细胞复苏：将步骤(5)冷冻的胎盘全细胞从液氮中取出，解冻至20%-70%冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗细胞，离心处理清洗DMSO，去除上清液，进行红细胞裂解步骤，离心处理后去除上清液，观察红细胞裂解情况，如有需要再重复红细胞裂解的步骤进行裂解，最后进行细胞清洗步骤，去除上清液；(C)进行以下对复苏的胎盘全细胞进行间充质干细胞分离和扩增的步骤：(7)细胞培养：向步骤(6)得到的胎盘全细胞中补加适量的间充质干细胞培养基重悬细胞，接种至培养容器，再将培养容器放进培养箱中进行培养，培养至第4-7天时将培养容器从培养箱中取出，进行第一次半换液，继续培养，在第8-10天时将培养容器从培养箱中取出，进行第二次半换液，继续培养，在第11-13天时将培养容器从培养箱中取出，加入5-20ml间充质干细胞培养基，往后每1-4天进行一次全换液；(8)细胞传代：当培养容器中的贴壁细胞融合率达到80%以后，利用消化酶TrypLe Express将贴壁细胞脱离容器底部，离心，抽走上清液，加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于培养容器进行传代并进行扩增培养，此后每1-3天换液一次，直至融合率达到80%后，即得胎盘间充质干细胞，对所得胎盘间充质干细胞进行传代；(9)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冷冻，备用，其中步骤(6)中，所述红细胞裂解步骤是加入PBS重悬细胞，向细胞悬液中再加入红细胞裂解液，细胞悬液与裂解液的比例为1 : 2至1 : 3，常温条件为15-25℃，培养时间为10-15分钟，所述间充质干细胞培养基中含有15重量份的FBS、1重量份的L-Glutamine、0.05重量份的Gentamicin和84重量份的DMEM-F12。 【当前权利人】博雅干细胞科技有限公司 【当前专利权人地址】江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号 【专利权人类型】有限责任公司 【统一社会信用代码】91320211553793530T 【引证次数】9.0 【被引证次数】6 【他引次数】9.0 【被自引次数】6.0 【家族引证次数】9.0 【家族被引证次数】33

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