【摘要】 本发明公开了一种制备无细菌松材线虫的方法。该制备无细菌松材线虫的方法包括：培养松材线虫；制备纯净松材线虫卵；用15%H2O2浸泡50-60min松材线虫卵；孵化松材线虫；培养松材线虫并进行无细菌鉴定，即制备出无细菌松材线虫。本发明的制备无细菌松材线虫的方法，利用松材线虫卵具有粘附于玻璃器皿上的特性，采用小培养皿进行卵的收集，进而用新配制的15%H2O2进行灭菌处理，获得无菌松材线虫卵，无菌卵孵化并在灰葡萄孢上大量繁殖后获得无细菌的松材线虫。在无菌条件下，用所获得的无细菌松材线虫对赤松无菌组织培养幼苗进行接种试验显示，无细菌松材线虫接种依然能使无菌苗发生萎蔫。表明采用该方法对松材线虫进行无细菌化并未使其失去致病性，是一种简易且成功的方法。 【专利类型】发明申请 【申请人】南京林业大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】210037 江苏省南京市龙蟠路159号 【申请人地区】中国 【申请人城市】南京市 【申请人区县】鼓楼区 【申请号】CN201010550230.7 【申请日】2010-11-19 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102084849A 【公开公告日】2011-06-08 【公开公告年份】2011 【授权公告号】CN102084849B 【授权公告日】2012-06-13 【授权公告年份】2012.0 【IPC分类号】A01K67/033 【发明人】叶建仁; 朱丽华; 吴小芹; 季锦衣 【主权项内容】1.一种制备无细菌松材线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备PDA培养基平板，接种灰葡萄孢到PDA培养基平板，控温25℃，培养5~7d至菌丝铺满平板，将松材线虫接种其中，控温25℃，培养5-7d，采用贝尔曼漏斗法分离松材线虫，收集松材线虫于无菌的离心管中，离心，去上清，再用无菌水清洗，离心，去上清，重复3-5次，保留2-3 ml松材线虫悬浮液备用；(2)将步骤(1)制备的松材线虫悬浮液置于无菌的小培养皿中，于25℃下产卵，4-10h后，用无菌水将松材线虫虫体彻底冲洗清除，获得粘附于小培养皿的纯净松材线虫卵；(3)将步骤(2)获得的粘附有松材线虫卵的小培养皿置于无菌的大培养皿中，加入新配制的15%H2O2至将其淹没，浸泡50-60min后取出，用无菌水清洗3次后，在小培养皿中加入少量无菌水后置于无菌的大培养皿中，控温25℃，培养30h孵化松材线虫；(4)将步骤(3)中孵化的松材线虫转移至灰葡萄孢平板，待松材线虫将灰葡萄孢吃尽后，于无菌条件下用灭菌的贝尔曼漏斗分离线虫，收集于无菌的离心管中，，2500 r/min离心3分钟，去上清，保留2-3ml，取部分松材线虫液进行无细菌鉴定，即制备出无细菌松材线虫。 【当前权利人】南京林业大学 【当前专利权人地址】江苏省南京市龙蟠路159号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】12320000466006885L 【引证次数】1.0 【被引证次数】17 【他引次数】1.0 【被自引次数】3.0 【被他引次数】14.0 【家族引证次数】1.0 【家族被引证次数】17

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