【摘要】 本发明涉及一种通过重组工程手段对恶臭假单胞菌KT2440进行基因敲除的方法。具体方法是首先通过重叠－延伸聚合酶链式反应的手段扩增而获得左右两侧分别为待敲除的靶基因上下游各约500个碱基对的同源基因，中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段。再将此DNA片段电转化至以终浓度为2mM间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的恶臭假单胞菌KT2440电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源片段之间的同源重组，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接获得了靶基因敲除的突变株。本发明所述方法简便快捷，可成为在生物降解有机化合物等方面有着重要应用价值的环境微生物恶臭假单胞菌KT2440的遗传操作手段。 【专利类型】发明申请 【申请人】南京师范大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】210046 江苏省南京市亚东新城区文苑路1号 【申请人地区】中国 【申请人城市】南京市 【申请人区县】栖霞区 【申请号】CN201010575202.0 【申请日】2010-12-06 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102071185A 【公开公告日】2011-05-25 【公开公告年份】2011 【授权公告号】CN102071185B 【授权公告日】2012-07-04 【授权公告年份】2012.0 【发明人】尚广东; 杨运文; 宋杰; 高九彩 【主权项内容】 一种恶臭假单胞菌KT2440高效的基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过重叠－延伸聚合酶链式反应的手段扩增而获得左右两侧分别为待敲除的靶基因上下游各500个碱基对的同源基因、中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段；(2)将含重组酶基因的质粒pLS512转化至恶臭假单胞菌KT2440中，制成电转化感受态细胞；(3)将步骤(1)的得到的DNA片段电转化至以终浓度为2mM间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的步骤(2)的恶臭假单胞菌KT2440电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源片段之间的同源重组，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接获得了靶基因敲除的突变株。 【当前权利人】南京师范大学 【当前专利权人地址】江苏省南京市亚东新城区文苑路1号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】123200004660067976 【被引证次数】12 【被自引次数】4.0 【被他引次数】8.0 【家族被引证次数】12

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