【摘要】 一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，属于中药及其制品和功能食品原料及其制品的指纹图谱技术领域。本发明包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝多糖的部分水解、灵芝多糖部分水解产物的PMP衍生化反应、反相HPLC指纹分析及其标准指纹图谱的确定。通过对15个不同产地的灵芝孢子粉样品的多糖成分的HPLC分析及其指纹图谱的比较，确定了其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。指纹图谱中共有峰19个，共有峰峰面积之和占总峰面积的98%，峰面积超过总峰面积5%的指纹峰4个。本方法稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握灵芝孢子粉多糖质量情况及产地，为灵芝孢子粉的质量控制和真伪鉴别提供了一种新的科学方法。 【专利类型】发明申请 【申请人】江南大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品科学与技术国家重点实验室 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201010561185.5 【申请日】2010-11-26 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102008515A 【公开公告日】2011-04-13 【公开公告年份】2011 【授权公告号】CN102008515B 【授权公告日】2012-01-25 【授权公告年份】2012.0 【发明人】戴军; 陈尚卫; 朱松; 王浩豪 【主权项内容】一种灵芝孢子粉多糖指纹图谱的构建方法，其特征在于包括灵芝孢子粉多糖的提取、灵芝孢子粉多糖的部分水解、灵芝孢子粉多糖部分水解产物的1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑琳酮PMP衍生化反应、反相高效液相色谱的指纹分析及其标准指纹图谱的确定；步骤为：(1)灵芝孢子粉多糖的提取：(a)对于破壁灵芝孢子粉：准确称取破壁灵芝孢子粉样品0.5~1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于水浴60~80℃功率300瓦超声30~60min，冷却后离心，残渣用少量超纯水洗涤并离心后，将两次上清液合并，合并后的上清液置于透析袋中用超纯水透析12小时，50~60℃真空浓缩近干，加超纯水溶解并定容至5mL作为粗多糖水溶液，待测；或(b) 对于未破壁灵芝孢子粉：准确称取未破壁灵芝孢子粉样品0.5~1.0g于50mL离心管中，加入30mL超纯水，于90~95℃水浴振荡恒温浸提2~3小时，再于水浴60~80℃功率300瓦超声30~60min，以下操作同(a)；(2)灵芝孢子粉多糖的部分水解：吸取100μL步骤(1)所得的粗多糖水溶液于5mL的具塞刻度试管中，加入100μL 的0.5mol/L 三氟乙酸TFA，充N2封管，100℃水解1 h；冷却后打开盖，真空干燥或用N2吹干，以去除TFA，再加200μL超纯水溶解水解产物，备用；(3)灵芝孢子粉多糖部分水解产物的PMP衍生化反应：取步骤(2)部分水解后超纯水溶解的水解产物100μL，加100μL 0.6M NaOH溶液，混匀；取其混合液50μL于5mL具塞试管中，再加等体积50μL的0.5 mol/L的PMP甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃的烘箱中反应30~100 min，取出放置10min冷却至室温；加60μL 0.3mol/L的HCl中和，加超纯水至1mL，再加等体积1mL的氯仿，振摇，静置，弃去氯仿相，重复萃取共3次；将水相用0.45μm微孔膜过滤后供HPLC进样分析；(4)反相高效液相色谱的指纹分析：反相高效液相色谱分析条件为：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB‑C18，250mm×4.6 mm i.d.,  5μm；流动相：pH 6.7的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液‑乙腈，磷酸盐缓冲液∶乙腈体积比为78~83∶22~17；柱温：20~35℃；检测波长：245~254 nm；流速：0.8~1 mL /min；进样体积：10~50μL；在此条件下进样分析步骤(3)过滤后的PMP衍生化产物，得到灵芝孢子粉多糖的高效液相色谱指纹图谱；(5)标准指纹图谱的确定：通过15个不同产地的灵芝孢子粉样品中的多糖水解产物的PMP衍生物的高效液相色谱测定，比较其色谱图，确定共有特征峰为 19个；所述的19个共有特征峰以葡萄糖峰为参照的相对保留时间RT的相对标准偏差RSD均小于2 %；即：1号峰平均RT为0.468，RSD为 0.40%；2号峰平均RT为0.490，RSD为 0.10%；3号峰平均RT为0.508，RSD为 0.31%；4号峰平均RT为0.523，RSD为 0.23%；5号峰平均RT为0.544，RSD为 0.10%； 6号峰平均RT为0.577，RSD为 0.12%；7号峰平均RT为0.603，RSD为 1.05%； 8号峰平均RT为0.647，RSD为 0.77%；9号峰平均RT为0.669，RSD为 0.10%；10号峰平均RT为0.725，RSD为 0.19%；11号峰平均RT为0.774，RSD为 0.08%；12号峰平均RT为0.842，RSD为 0.07%；13号峰平均RT为0.876，RSD为 0.21%；14号峰平均RT为0.912，RSD为 0.08%；15号峰平均RT为1.000，RSD为0；16号峰平均RT为1.131，RSD为0.06%；17号峰平均RT为1.215，RSD为0.09%；18号峰平均RT为1.256，RSD为0.09%；19号峰平均RT为1.482，RSD为0.07%；其中超过总峰面积5%的指纹峰有4个，分别为：2号峰甘露糖，相对峰面积5.12%~9.11%；15号峰葡萄糖，相对峰面积20.94%~48.47%；16号峰半乳糖，相对峰面积10.38%~54.41%；19号峰岩藻糖，相对峰面积5.19%~14.31%。 【当前权利人】焦广俪; 颜秉东 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】1210000071780177X1 【被引证次数】32 【被他引次数】30.0 【家族被引证次数】34

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