【摘要】 本发明公开了一种血管钠肽(VNP)的制备方法，为克服传统VNP化学合成法价格昂贵，生物活性低等缺陷，本发明在制备VNP过程中，用PCR技术扩增目的基因，以pGEX-4T-1为载体质粒酶切后定向插入VNP目的基因后形成重组质粒，以大肠杆菌BL21(DE3)作为表达菌株，以GST亲和柱分离目的蛋白，这种方法既能获得较高表达量的蛋白，又能通过亲和性得到较纯的蛋白。运用本发明技术获得的VNP比起化学合成法具有更好的生物学活性，且成本较化学合成法要低，为VNP进一步通过生物法生产奠定了基础。 【专利类型】发明申请 【申请人】江南大学; 中国人民解放军第四军医大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学医药学院 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201010503402.5 【申请日】2010-10-12 【申请年份】2010 【公开公告号】CN101979576A 【公开公告日】2011-02-23 【公开公告年份】2011 【IPC分类号】C12N15/16; C12N15/70; C07K14/575 【发明人】金坚; 于军; 李鹏; 房聪; 陈蕴; 朱瑞宇; 雷楗勇; 姜曰水; 朱妙章; 陈健康 【主权项内容】血管钠肽(VNP)的制备方法，其特征在于以下步骤：采用PCR技术将表达VNP的目的基因扩增，并纯化其产物；将纯化的PCR产物用EcoR I与Not I双酶切后定向插入经同样双酶切的pGEX‑4T‑1，获得重组质粒pGEX‑4T‑1‑VNP；将重组质粒pGEX‑4T‑1‑VNP转化至大肠杆菌JM 109，经培养扩增，抽提纯化，测序分析，获得序列正确的重组质粒；将测序正确的重组质粒转化至BL21(DE3)菌，在30℃，0.5mM IPTG条件下表达重组蛋白；将表达重组蛋白的活化菌接种到LB+AMP的培养基中，进行摇瓶实验，工程菌在发酵罐中发酵，至OD600nm0.8时进行IPTG诱导，6小时后放罐，离心得到菌体；将离心后的菌体沉淀进行细胞破碎，破碎后离心收集上清液，进行GST亲和层析，洗脱得到融合蛋白GST‑VNP；将洗脱得到的融合蛋白GST‑VNP通过Sephadex G25凝胶过滤脱盐，后采用肠激酶切割。切割条件：25℃，pH 7.6，12小时；酶切后的产物再经GST亲和层析去掉GST标签，采用截留分子量为10000的超滤离心管对酶切后的样品进行纯化，去除少量的残余肠激酶，得到纯品VNP。将纯品VNP在大鼠上采用离体血管环张力法和去膀胱尿液收集法活性评价。 【当前权利人】江南大学; 中国人民解放军第四军医大学 【当前专利权人地址】江苏省无锡市蠡湖大道1800号江南大学医药学院; 陕西省西安市新城区长乐西路169号 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】1210000071780177X1 【引证次数】2.0 【被引证次数】4 【他引次数】2.0 【被自引次数】1.0 【被他引次数】3.0 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】4

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