【摘要】 一种采用磁性纳米粒子提取细菌基因组DNA的方法，属于纳米材料和分子生物学技术领域。本发明包括磁性纳米粒子聚集体的制备，细菌裂解液的配制，吸附缓冲液的配制及添加，磁铁吸附，用70%的乙醇漂洗，用TE缓冲液洗脱，获得细菌基因组DNA溶液。本发明利用合成的磁性纳米粒子提取细菌基因组DNA，相比传统的酚/氯仿DNA提取方法，整个实验耗时短，操作简单，提取效率高，具有快速、简便、灵敏、得率高等优点，提取的细菌基因组DNA完全可以用于DNA杂交和PCR等后续实验，为以后的研究分析提供了基础。 【专利类型】发明申请 【申请人】江南大学 【申请人类型】学校 【申请人地址】214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品学院 【申请人地区】中国 【申请人城市】无锡市 【申请人区县】滨湖区 【申请号】CN201010602179.X 【申请日】2010-12-23 【申请年份】2010 【公开公告号】CN102121002A 【公开公告日】2011-07-13 【公开公告年份】2011 【IPC分类号】C12N15/10; C12N15/31 【发明人】王利兵; 胥传来; 勇倩倩; 邓小芳; 屈昌龙; 刘微波; 赵书阁 【主权项内容】1.一种采用磁性纳米粒子提取细菌基因组DNA的方法，其特征在于包括磁性纳米粒子聚集体的制备，细菌裂解液的配制，吸附缓冲液的配制及添加，磁铁吸附，用70%的乙醇漂洗，用TE缓冲液洗脱，获得细菌基因组DNA溶液； (1)磁性纳米粒子聚集体的制备： ①称取0.65g无水三氯化铁和0.4g柠檬酸三钠，量取20mL乙二醇，搅拌20min，使之全部溶解； ②称取1.2g无水乙酸钠加入到上述反应体系中，搅拌10min，置于四氟乙烯反应釜中油浴加热至230℃，同时进行磁力搅拌，反应10h后停止加热，继续磁力搅拌冷却至室温； ③反应后的溶液加入20mL的无水乙醇，超声清洗10min，5000rpm离心10min，弃上清； ④下层沉淀加入20mL无水乙醇，超声清洗10min，5000rpm离心10min，弃上清； ⑤下层沉淀加入20mL去离子水，超声清洗10min，5000rpm离心10min，弃上清； ⑥下层沉淀悬浮于10mL去离子水中，得磁性纳米粒子聚集体，室温保存备用； (2)细菌裂解液的配制： 对于革兰氏阴性菌，取1mL细菌增菌液于2mL灭菌离心管，10000rpm离心5min，倒掉上清液，将沉淀溶解于1mL细菌裂解液中，涡旋震荡15s混合均匀，70℃水浴10min； 所述细菌裂解液组成为：50mM Tris-HCl，10mM EDTA，1% SDS，5mg/mL蛋白酶K，pH8.0； 或对于革兰氏阳性菌，取1mL细菌增菌液于2mL灭菌离心管，10000rpm离心5min，倒掉上清液，将沉淀溶于500μL缓冲液A中，涡旋震荡15s混合均匀，37℃水浴30min后，加入500μL缓冲液B中，涡旋震荡15s混合均匀，70℃水浴10min； 所述缓冲液A组成为：含50mM Tris-HCl、10mM EDTA、1.2%曲拉通、20mg/mL溶菌酶，pH8.0； 所述缓冲液B组成为：含1% SDS、5mg/mL蛋白酶K，pH8.0； (3)吸附缓冲液的配制及添加： 配制吸附缓冲液10%/6M的PEG/NaCl水溶液，其中聚乙二醇6000质量浓度10%、NaCl浓度6M； 在步骤(2)所得1mL细菌裂解液中加入制备好的磁性纳米粒子聚集体10μL，再加入吸附缓冲液PEG/NaCl水溶液500μL，使NaCl终浓度控制为2M，上下颠倒数次，混合均匀，震荡反应10min，获得吸附细菌基因组DNA的磁性纳米粒子； (4)磁铁吸附：用磁铁将吸附有细菌基因组DNA的磁性纳米粒子与溶液分离，倒掉上清液； (5)用70%的乙醇漂洗：用70%乙醇漂洗液清洗吸附有细菌基因组DNA的磁性纳米粒子两次，室温放置0.5h，使残留乙醇挥发完全； (6)用TE缓冲液洗脱：加入50μLTE缓冲液，混匀后65℃水浴孵育10min，磁分离，取上清，即为细菌基因组DNA溶液，保存于-20℃，备用； 所述TE缓冲液为：含10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0的混合溶液。 【当前权利人】江南大学 【当前专利权人地址】江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号江南大学食品学院 【专利权人类型】公立 【统一社会信用代码】1210000071780177X1 【被引证次数】6 【被他引次数】6.0 【家族被引证次数】6

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