【摘要】 本发明涉及一种人血清白蛋白在毕赤氏酵母 (Pichia pastors)中的表达与纯化方法。本发明的方法特征在于重 组表达质粒pPKQ－HSA的构建和表达HSA的高效分离纯 化。用该方法获得的样品纯度高于99%。 【专利类型】发明申请 【申请人】中国科学院上海生物化学研究所; 上海第一生化药业公司 【申请人类型】企业,科研单位 【申请人地址】200031上海市岳阳路320号 【申请人地区】中国 【申请人城市】上海市 【申请人区县】徐汇区 【申请号】CN98110844.X 【申请日】1998-05-15 【申请年份】1998 【公开公告号】CN1235981A 【公开公告日】1999-11-24 【公开公告年份】1999 【授权公告号】CN1119352C 【授权公告日】2003-08-27 【授权公告年份】2003.0 【IPC分类号】C07K14/765; C12N1/19; C12R1/84; C07K14/435 【发明人】袁中一; 邱荣德; 吴祥甫; 李士云; 夏其昌; 储瑞蔼 【主权项内容】1、一种高表达人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母重组细胞的构建表达 和纯化方法，其特征在于该方法包括下列步骤： 一、人血清白蛋白cDNA的获得： (1)人胚肝细胞总RNA的抽提 按照Trizol？RNA抽提试剂盒推荐方法，从中国人胚肝细胞中抽 提总RNA； (2)pre-HSA？cDNA合成和PCR体外扩增 根据已知天然HSA基因5’和3’端序列，设计引物： 引物1 : 5’CGGAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGC？3’ 引物2 : 5’CGGGATCCACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC？3’ 以抽取的人肝白细胞总RNA为模板，反转录合成人血清白蛋白 pre-HSA？cDNA， (3)所构建的基因5’端BamH1位点与ATG之间插入了一段 Kozak序列5’CCACC3’, 3’端紧接基因的终止密码含一EcoR1a位 点。 二、HSA在巴斯德毕赤酵母(Pichia？pastoris)中的表达 (1)重组表达质粒pPKQ-HSA的构建： 将PUC19-HSA克隆载体中pre-HSA基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切下，1％琼脂糖电泳分离，并用酚/氯仿回收。将约2Kb的 pre-HSA基因回收片段与用相同酶切的pPIC3.5K表达载体连接，转 化E.coli？TG1感受态细胞，涂布氨苄青霉素板筛选阳性克隆。采用 碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切 鉴定出重组质粒pPKQ-HSA。 (2)表达质粒pPIC9-HSA和pPIC9k-HSA的构建 设计引物： 引物3： 5’CGCTCGAAAAGGGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAA？3’ 用引物3和引物1从PUC19-HSA上PCR扩增HSA？cDNA片段，酚 /氯仿抽提PCR产物后，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切回收。再与用相同酶切 的pPIC9质粒连接，转化E.coli？TG1感受态细胞。涂布氨苄青霉素 板筛选阳性克隆。采用碱裂解法制备质粒DNA。所得质粒DNA用 XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定重组质粒pPIC9-HSA， 取4个经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切初步鉴定的重组克隆，制备高纯 度质粒DNA，采用5’AOX1？primer和3’AOX1？primer(Invitrogen)， 测定重组质粒HSA？cDNA两端序列。结果有三个含完全正确的阅读 框。经测序验证的pPIC9-HSA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切并回收含 HSA基因片段，与相同酶切的pPIC9-HSA质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶 切并回收含HSA基因片段，与用相同酶切的pPIC9k质粒连接，转 碱裂解法制备质粒DNA，所得质粒DNA用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴 定得重组质粒pPIC9k-HSA。 (3)重组质粒pPKQ-HSA转化毕赤酵母细胞GS115(his4Mut+) 将构建的重组表达质粒pPKQ-HSA和pPIC9k-HSA用SalⅠ或 BglⅡ酶切线性化。同时将空载pPIC3.5k和pPIC9k质粒相同酶切线 性化，酚/氯仿抽提回收并溶解于无菌水中。按照Invitrogen, Pichia Expression？Kit？Instruction？Manual(Version？E)方法电转化GS115细 胞，涂布含不同浓度G418的YPD平板，获得不同G418抗性的阳 性克隆，经MD平板验证his+表型获得GS115/HSA重组克隆 S1B119。 (4)重组克隆pichia？pastoris？GS115/HSA？S1B119株细胞的表达 将筛选出的GS115/HSA重组细胞接种3ml？YPD试管，30℃ 300rpm培养过夜，再以0.2％～0.5％接种量接种50ml？BMGY, 30℃、 300rpm培养至OD600？4～7。离心收集菌体悬于15ml含甲醇的BMMY 培养液中，置20-30℃摇床诱导培养，每24hr加甲醇到0.5ml/L。定 时取样，经4℃离心，上清加入PMSF至1mM, -20℃冻存； 三、表达HSA的分离纯化 (1)中空纤维柱 将2L低密度诱导发酵液除细胞后用截留分子量10KDa-50KDa 的中空纤维柱除去低于50KDa的杂质并使浓缩到0.2L浓缩液。 HSA收率为95％； (2)脱色浓缩发酵液经50℃保温后，加入3％活性炭或732等脱 色树脂处理10分钟后离心除去，得脱色浓缩液； (3)pharose疏水柱分离 浓缩发酵液或脱色浓缩液中加入固体(NH4)2SO4至20％并流过 (NH4)2SO4平衡的Phenyl-Sepharose柱，上样后用平衡液洗涤至流出 液OD280＜0.01后改用水洗脱，收集用水洗脱的HSA蛋白，收率为 95％； (4)亲和层析除杂蛋白 ①无HSA发酵液抗血清-Sepharose制备：由1所得浓缩发酵 流经抗HSA抗体-Sepharose除去HSA。流出液为无HSA发酵液， 按发明人论文[徐俊等，生物工程学报1993, 9(1)69-73]方法将无HSA 发酵液制得的抗血清，通过醛基结合于Sepharose； ②疏水层析纯化得到的水洗脱峰通过“无HSA发酵液的抗血 清”亲和柱，收集未吸附的蛋白峰为HSA，回收率≥98％； (5)超滤脱盐 将亲和层析漏出蛋白峰经截留分子量10KDa中空纤维或超滤膜 组件中脱盐。可得纯度≥99％的HSA，回收率≥98％； (6)真空冷冻干燥 将脱盐后的HSA溶液真空冷冻干燥得到HSA样品。 【当前权利人】中国科学院上海生物化学研究所; 上海第一生化药业公司 【当前专利权人地址】上海市岳阳路320号; 【引证次数】1.0 【被引证次数】40.0 【他引次数】1.0 【被他引次数】40.0 【家族引证次数】2.0 【家族被引证次数】43.0

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